【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于遗传转化，更具体地说，涉及一种发根农杆菌介导的梨转基因方法。
技术介绍
1、梨为蔷薇科((rosaceae)苹果亚科(maloideae)梨属(pyrus.l)植物，是世界上重要的落叶果树之一，根据起源的不同可以分为东方梨和西洋梨，东方梨主要包括白梨、秋子梨、砂梨和新疆梨。‘山梨1号’属于秋子梨的野生种，具有很强抗寒性和抗逆性，适应性强，常用作砧木；‘康弗伦斯’为西洋梨的栽培品种，抗寒力中等，抗腐烂病能力差，但果实商品价值高。
2、梨树作为我国重要的果树之一，由于其自交不亲和性和童期长，导致育种周期长、效率低。因此，利用基因工程技术加速培育具有优良性状的新梨品种成为梨产业的紧迫任务。建立高效的梨遗传转化体系不仅有利于深入研究关键基因的生物学功能，还能为精准改良品质性状提供技术支撑。然而，采用根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导的转化方法获得阳性芽通常需要5到6个月，转化效率仅约为2％。此外，转换过程中可能出现嵌合体，这增加了转化工作的复杂性和功能基因验证所需的时间。
3、发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)与根癌农杆菌一样，同属于根瘤菌科(rhizoliaceae)下的农杆菌属(agrobacterium)。它具有一个环状基因组dna，称为ri质粒，其具有独立于细胞核的遗传复制能力。ri质粒上的t-dna携带着与毛状根的形成和生长素合成相关的基因，使得受体植物在未添加植物激素的培养基上能够产生出可以自发生长的毛状根。通过发根农杆菌转化产
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种发根农杆菌介导的梨转基因方法。
2、一种发根农杆菌介导的梨转基因方法，构建包含筛选标记基因mcherry和目的基因的重组表达载体，将鉴定正确的重组表达载体转入发根农杆菌，利用该发根农杆菌制备侵染液，用于侵染经过预培养的继代组培苗叶片，随后经过共培养，再诱导获得再生的转基因阳性根。
3、作为本专利技术的一种优选，所述的表达载体构建方法为：采用golden gate组装法将筛选标记mcherry(fpbase登录号：zerb6)与目的基因构建到载体pgg8-17(seq id no.1)上，mcherry由花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子启动，目的基因由拟南芥ubq10基因(at4g05320)的启动子启动。
4、作为本专利技术的一种优选，利用冻融转化法，将鉴定正确的重组载体转入发根农杆菌k599感受态细胞。
5、作为本专利技术的一种优选，所述的发根农杆菌侵染液的制备方法为：将发根农杆菌在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素的ty固体培养基上划线活化，28℃培养2d后，挑取单菌落接种于含有50mg/l卡那霉素、50mg/l链霉素、1m cacl2的ty液体培养基中，28℃摇床180rpm振荡培养扩繁，取过夜培养的菌液添加到新的含50mg/l卡那霉素、50mg/l链霉素、1mcacl2的ty液体培养基中，28℃摇床180rpm振荡培养至对数生长期，5000r/min离心5min收集菌体，弃去上清，以ms液体培养基(100μm乙酰丁香酮，ph 5.8)为重悬液，将侵染液稀释至所需的od600值，用于后续试验。
6、作为本专利技术的一种优选，移除梨组培苗老叶，并置于ms+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂培养基上生长1个月，随后选取组培苗顶端嫩叶，切除叶柄，放置在ms固体培养基上预培养0-1d获得所述的经过预培养的继代组培苗的叶片。
7、作为本专利技术的一种优选，所述的梨组培苗品种选自‘山梨1号’或‘康弗伦斯’。
8、作为本专利技术的一种优选，‘山梨1号’放置在ms固体培养基上预培养1d，‘康弗伦斯’不需要预培养。
9、作为本专利技术的一种优选，发根农杆菌侵染的流程为：经过预培养的继代组培苗的叶片浸泡在发根农杆菌侵染液中；将接种后的叶片吸干菌液置于共培养基中培养；转移到毛状根诱导培养基上进行暗培养，再光照培养26～28d即得到梨转基因根。
10、作为本专利技术的进一步优选，所述发根农杆菌侵染时间，‘山梨1号’优选10min，‘康弗伦斯’优选20min。
11、作为本专利技术的进一步优选，所述共培养培养基为ms+30g/l蔗糖+100μm乙酰丁香酮+7g/l琼脂，ph为5.80～5.85；共培养时间‘山梨1号’为5d，‘康弗伦斯’为3d。
12、作为本专利技术的进一步优选，所述毛状根诱导培养基：‘山梨1号’为1/4ms+30g/l蔗糖+500mg/l特美汀+7g/l琼脂，ph 5.80～5.85，‘康弗伦斯’为1/8ms+30g/l蔗糖+125mg/l特美汀+7g/l琼脂，ph5.80～5.85；所述暗培养时间‘山梨1号’为1d，‘康弗伦斯’为5d。
13、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
14、(1)本专利技术利用发根农杆菌k599侵染‘山梨1号’和‘康弗伦斯’组培苗叶片，通过对预培养时间、菌液od600值、侵染时间、共培养时间、毛状根诱导培养基成分、暗培养时间的控制获得转基因阳性根。不同品种转基因毛状根的诱导能力具有显著差异，‘山梨1号’毛状根的诱导效率远高于‘康弗伦斯’，为75％左右。此外，本专利技术的转基因方法操作简单，培养条件容易控制，周期短，且毛状根可在不添加外源激素的培养基上自主生长，转入的目的基因能够在毛状根中长期稳定表达。
15、(2)本专利技术利用红色荧光蛋白mcherry作为筛选标记，因此转基因根具有明显的红色荧光信号，而未转化的根则不具有该信号。可配合使用双波长荧光蛋白激发光源luyor-3415rg(luyor，上海，中国)进行快速筛选。
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1.一种发根农杆菌介导的梨转基因方法，其特征在于：构建包含筛选标记基因mCherry和目的基因的重组表达载体，将鉴定正确的重组表达载体转入发根农杆菌，利用该发根农杆菌制备侵染液，用于侵染经过预培养的继代组培苗叶片，随后经过共培养，再诱导获得再生的转基因阳性根。
2.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，重组表达载体的构建方法为：采用Golden gate组装法将FPbase登录号为ZERB6的筛选标记mCherry与目的基因构建到载体pGG8-17上获得重组表达载体，其中，mCherry由花椰菜花叶病毒35S启动子启动，目的基因由拟南芥UBQ10基因的启动子启动。
3.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，利用冻融转化法，将鉴定正确的重组载体转入发根农杆菌K599感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，发根农杆菌侵染液的制备方法为：将发根农杆菌在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的TY固体培养基上划线活化，28℃培养2d后，挑取单菌落接种于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素、1M Ca
5.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，移除梨组培苗老叶，并置于MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂培养基上生长1个月，随后选取组培苗顶端嫩叶，切除叶柄，放置在MS固体培养基上预培养0-1d获得所述的经过预培养的继代组培苗叶片。
6.根据权利要求5所述的梨转基因方法，其特征在于，所述的梨组培苗品种选自‘山梨1号’或‘康弗伦斯’。
7.根据权利要求6所述的梨转基因方法，其特征在于，‘山梨1号’放置在MS固体培养基上预培养1d，‘康弗伦斯’不需要预培养。
8.根据权利要求7所述的梨转基因方法，其特征在于，发根农杆菌侵染‘山梨1号’的流程为：经过预培养的继代组培苗叶片浸泡在OD600为0.7的侵染液中10min；随后吸干叶片表面菌液置于共培养培养基中培养5d；转移到毛状根诱导培养基上暗培养1d进行毛状根诱导，再光照培养26～28d即得到梨转基因根；其中，所述的共培养培养基配方为：MS+30g/L蔗糖+100μM乙酰丁香酮+7g/L琼脂，pH为5.80～5.85；所述的毛状根诱导培养基配方为：1/4MS+30g/L蔗糖+500mg/L特美汀+7g/L琼脂，pH 5.80～5.85。
9.根据权利要求7所述的梨转基因方法，其特征在于，所述的发根农杆菌侵染‘康弗伦斯’的流程为：切下的继代组培苗叶片直接浸泡在OD600为0.1的侵染液中20min；随后吸干叶片表面菌液置于共培养培养基中培养3d；转移到毛状根诱导培养基上暗培养5d进行毛状根诱导，再光照培养26～28d即得到梨转基因根；其中，所述的共培养培养基配方为：MS+30g/L蔗糖+100μM乙酰丁香酮+7g/L琼脂，pH为5.80～5.85；所述的毛状根诱导培养基配方为：1/8MS+30g/L蔗糖+125mg/L特美汀+7g/L琼脂，pH 5.80～5.85。
...【技术特征摘要】
1.一种发根农杆菌介导的梨转基因方法，其特征在于：构建包含筛选标记基因mcherry和目的基因的重组表达载体，将鉴定正确的重组表达载体转入发根农杆菌，利用该发根农杆菌制备侵染液，用于侵染经过预培养的继代组培苗叶片，随后经过共培养，再诱导获得再生的转基因阳性根。
2.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，重组表达载体的构建方法为：采用golden gate组装法将fpbase登录号为zerb6的筛选标记mcherry与目的基因构建到载体pgg8-17上获得重组表达载体，其中，mcherry由花椰菜花叶病毒35s启动子启动，目的基因由拟南芥ubq10基因的启动子启动。
3.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，利用冻融转化法，将鉴定正确的重组载体转入发根农杆菌k599感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，发根农杆菌侵染液的制备方法为：将发根农杆菌在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素的ty固体培养基上划线活化，28℃培养2d后，挑取单菌落接种于含有50mg/l卡那霉素、50mg/l链霉素、1m cacl2的ty液体培养基中，28℃摇床180rpm振荡培养扩繁，取过夜培养的菌液添加到新的含50mg/l卡那霉素、50mg/l链霉素、1m cacl2的ty液体培养基中，28℃摇床180rpm振荡培养至对数生长期，5000r/min离心5min收集菌体，弃去上清，以ph 5.8含100μm乙酰丁香酮的ms液体培养基为重悬液，将侵染液稀释至所需的od600值，用于后续试验。
5.根据权利要求1所述的梨转基因方法，其特征在于，移除梨组培苗老叶，并置于ms+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛程，吴俊，刘君君，常丽艳，顾凯迪，郑朋飞，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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