【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
本专利技术涉及比苏卡林(bisucaberins)、去铁胺及其类似物的单体的生物技术生产。具体地，本专利技术涉及能够生物技术生产n5-氨基戊基-n-(羟基)-琥珀酰胺酸、n-羟基-n-琥珀酰腐胺以及由此的化合物的重组细胞。
技术介绍
0、专利技术背景
1、去铁胺、比苏卡林和其它基于n-羟基-n-琥珀酰戊二胺的大环铁载体因其在各种疾病例如癌症、继发性铁过载等等的治疗中的用途而在几个行业中众所周知。这些基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体通过专门的生物合成途径由单体例如n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺生产，所述途径需要四种酶促活性并从l-赖氨酸开始。
2、基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体，例如去铁胺b、h、e、x1、x2、比苏卡林(bisucaberin)、比苏卡林b(bisucaberin b)等等，目前通过细菌毛链霉菌(streptomycespilosus)(毛链霉菌(s.pilosus))和其它放线菌属(actinomycetes)从赖氨酸开始生产。特别地，这些基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺(这些基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体由其寡聚化并然后大环化)通过专门的生物合成途径产生，所述途径需要四种酶促活性并从l-赖氨酸开始。
3、占优势地用于这些制药应用中的基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺，当今唯一地通过使用野
4、即，目前的生产方法具有较低的生产性能特性，例如生物质比生产率qp、体积生产率qp、底物上的产物产率yx/s和产物浓度。这导致高制造成本。进一步地，因为基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺使用野生型链霉菌属菌株的简单发酵过程形成，所以在产生的发酵液中存在很多副产物。链霉菌属物种是许多次级代谢产物包括抗生素的有力生产者，所述次级代谢产物需要通过费力且昂贵的精制步骤与所需的靶化合物分开。另外，由于链霉菌属物种的复杂生长要求，野生型链霉菌属菌株通常需要复杂且昂贵的发酵培养基配方，导致由于复杂培养基组分的分批间变动的弱重现性。
5、进一步地，使用赖氨酸作为生产的主要碳底物也使得形成基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的过程不灵活且昂贵。
6、虽然对于制药应用，高制造成本可能是可接受的，但这些成本对于其它应用例如化妆品和技术(例如除锈)领域是不期望的。因此，将基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的生物合成转移到充分表征的微生物生产菌株是高度期望的。相应地，本领域需要更有效且实惠的生物合成基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的手段。
7、专利技术描述
8、本专利技术尝试通过提供使用已建立的微生物平台来生产基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及其单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的生物技术手段来解决上述问题。使用已建立的微生物平台来生产至少一种基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺不仅增加了从原材料生产的靶产物的量，而且降低了所形成的副产物的量。另外，根据本专利技术的任何方面的遗传修饰的细胞具有非致病性和易于培养的优点。这使得细胞对于生产是更安全的，并且还保持成本更低，因为在实验室中的生产过程中以及基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及其单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的使用方面不需要专门的安全性要求。使用根据本专利技术的任何方面的重组细胞，还增加了基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的生产效率。另外，能够整合将碳源转换为至少一种基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及其单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的整体手段的微生物平台的使用，使得转换过程更简单，因为在转换中仅涉及少数工艺步骤。还去除了链霉菌属菌株用于生产基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的依赖。根据本专利技术的任何方面的细胞具有能够使用各种碳底物来生产根据本专利技术的任何方面的基于n-羟基-n-琥珀酰二胺的大环铁载体以及单体n-羟基-n-琥珀酰尸胺和n-羟基-n-琥珀酰腐胺的进一步优点。例如，简单的碳例如葡萄糖可以用作碳底物。
9、根据本专利技术的任何方面使用的细胞产生包括以下的几个优点：
10、-更高的生产性能特性，例如生物质比生产率qp、体积生产率qp、底物上的产物产率yx/s和产物浓度，导致更低的制造成本；
11、-发酵液中的副产物的更低多样性和/或浓度或不存在简化了精制策略，导致更低的制造成本；和
12、-成分确定的最小发酵培养基的适用性，导致更低的制造成本和更佳的重现性。
13、根据本专利技术的一个方面，提供了用于从至少一种简单碳源产生至少一种式i的化合物的重组微生物细胞：
14、
15、其中n是1或2
16、其中所述简单碳源选自葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘油及其组合，并且其中所述细胞包含进一步的遗传修饰，以增加从至少一种简单碳源的l-赖氨酸产生。
17、在一个实例中，n是2并且所产生的化合物是n-羟基-n-琥珀酰尸胺，也称为n5-氨基戊基-n-(羟基)-琥珀酰胺酸。在另一个实例中，n是2并且所产生的化合物是n-羟基-n-琥珀酰腐胺。在另一个实例中，通过根据本专利技术的任何方面的细胞在混合物中产生化合物n5-氨基戊基-n-(羟基)-琥珀酰胺酸和n-羟基-n-琥珀酰腐胺两者。
18、特别地，n是2并且所产生的化合物是n-羟基-n-琥珀酰尸胺，也称为n5-氨基戊基-n-(羟基)-琥珀酰胺酸。
19、如本文使用的，术语‘重组体’指这样的分子或者由此类分子编码，特别是多肽或核酸，其像这样并非天然存在的，而是遗传改造的结果，或者指包含重组分子的细胞。例如，如果核酸分子包含与编码催化活性多肽的序列在功能上连接的启动子，并且启动子已这样进行改造，使得催化活性多肽相对于包含原始未改变的核酸分子的相应野生型细胞中的多肽水平是过表达的，则所述核酸分子是重组体。此外，术语“重组dna”指这样的核酸序列，其并非天然存在的，或者已通过两个否则分开的核酸序列区段的人工组合，即通过将通常并非连续的dna小片连接在一起进行制备。“重组产生的”意指经常通过化学合成手段或通过分离的核酸区段的人工操作来实现的人本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于从至少一种简单碳源产生至少一种式I的化合物的重组微生物细胞：
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞包含遗传修饰以相对于其野生型细胞增加选自E1、E2和E3的至少两种酶的活性，其中：
3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞包含遗传修饰以相对于其野生型细胞增加酶E2和E3的活性。
4.根据权利要求2或3所述的细胞，其中所述细胞包含遗传修饰以相对于其野生型细胞增加三种酶E1、E2和E3的活性。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的细胞，其中所述遗传修饰是
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞中的进一步的遗传修饰是
7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述进一步的遗传修饰是：
8.根据权利要求2至7中任一项所述的细胞，其中
9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自曲霉属物种、棒状杆菌属物种、短杆菌属物种、芽孢杆菌属物种、不动杆菌属物种、产碱杆菌属物种、乳杆菌属物种、副球菌属物种、乳球菌属物种、假丝酵母属物种、毕赤酵母属物种、汉逊酵母
10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含进一步的遗传修饰，以相对于野生型细胞增加选自以下的至少一种E4酶的表达：
11.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含进一步的遗传修饰，以相对于野生型细胞增加选自以下的至少一种E4酶的表达：
12.一种从至少一种简单碳源产生至少一种式I的化合物的方法，
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述酶的活性通过选自以下的方法在细胞中得到增加：
14.根据权利要求1至11中任一项所述的细胞用于从至少一种简单碳源产生至少一种式I的化合物的用途
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于从至少一种简单碳源产生至少一种式i的化合物的重组微生物细胞：
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞包含遗传修饰以相对于其野生型细胞增加选自e1、e2和e3的至少两种酶的活性，其中：
3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞包含遗传修饰以相对于其野生型细胞增加酶e2和e3的活性。
4.根据权利要求2或3所述的细胞，其中所述细胞包含遗传修饰以相对于其野生型细胞增加三种酶e1、e2和e3的活性。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的细胞，其中所述遗传修饰是
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞中的进一步的遗传修饰是
7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述进一步的遗传修饰是：
8.根据权利要求2至7中任一项所述的细胞，其中
9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自曲霉属物种、棒状杆菌属物种、短杆菌属物种、芽孢杆菌属物种、不动杆菌属物...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·沙费尔，M·韦泽尔，A·蒂曼，H·H·温克，
申请(专利权)人：赢创运营有限公司，
类型：发明
国别省市：
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