本发明专利技术涉及α‑凝血酶环状NU核酸适配体、制备方法、解毒剂及应用。α‑凝血酶环状NU核酸适配体的制备方法，包括：将待环化适配体与双发夹辅助链混合退火，得第一混合溶液，加入T4连接酶控温反应，得第二混合溶液，浓缩，加入甘油和甲酰胺混合溶解，得第三混合溶液；将第三混合溶液纯化，得α‑凝血酶环状NU核酸适配体。本发明专利技术还提供制备方法制得的α‑凝血酶环状NU核酸适配体。本发明专利技术还提供α‑凝血酶环状NU核酸适配体的解毒剂。本发明专利技术解决了线性α‑凝血酶NU核酸适配体易被核酸酶水解导致血液半衰期短、热稳定性较差的问题。本发明专利技术实现了对α‑凝血酶环状NU核酸适配体的抗凝作用的高效逆转。
1、核酸适配体，作为一类新兴的生物识别分子，由短链dna或者rna构成，具有独特的三维折叠结构，能够以高亲和力和特异性结合各种靶标分子，其应用范围涵盖了从简单金属离子、有机染料、氨基酸、肽、酶、蛋白质、整个细胞到复杂生物体(例如细菌和病毒)的广泛领域。与传统抗体相比，核酸适配体展现出显著的优势，包括容更小的体积、更低的免疫原性、在宽泛的ph和温度范围内保持稳定的特性，以及便于合成和进行化学修饰的能力。这些优势共同奠定了核酸适配体在生物医药、诊断学及生物技术等多个领域的广泛应用基础。
2、特别是在生物医药领域，针对α-凝血酶这一关键靶点，通过体外selex技术筛选获得的凝血酶核酸适配体，如nu172，已成为研究的热点。这些适配体不仅展示了高亲和力结合凝血酶的能力，还通过其独特的双链结构在一定程度上稳定了g-四链体区域并提高了抗酶解能力。然而，该凝血酶核酸适配体的双链区域暴露的末端碱基仍然会迅速被核酸酶识别，使其在生理环境中的半衰期受到限制，无法达到体内抗凝的长效需求。
3、为了克服这一挑战，科研界已探索并报道了多种策略以延长适配体的体内半衰期。例如：对适配体骨架进行化学修饰，设计多价适配体结构，以及通过引入外源分子对适配体进行末端共价连接，等。这些策略虽在一定程度上提高了适配体的体内稳定性，但同时也伴随着成本高、制备过程复杂、产率不理想以及易引入外源化合物残留等问题，限制了其在实际应用中的广泛推广。
r/>技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供α-凝血酶环状nu核酸适配体、制备方法及应用，以解决线性α-凝血酶核酸适配体nu172存在的易被核酸酶水解导致血液半衰期短、热稳定性较差的问题。本专利技术的目的之二在于提供解毒剂及制备方法，以实现对α-凝血酶环状nu核酸适配体的抗凝作用的高效逆转。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、α-凝血酶环状nu核酸适配体，所述α-凝血酶环状nu核酸适配体为cnudx+y+1；所述
4、cnudx+y+1的核苷酸序列如seq id no:15所示，x和y的取值为正整数。
5、其中，seq id no:15单链核酸：
6、(n)xtttt(n’)x(n)yctaggttgggtagggtggtg(n’)y；x和y的取值为正整数，n和n’对应a、t、c、g中的任意碱基；(n)x和(n)y分别与(n’)x和(n’)y互补配对。
7、所述α-凝血酶环状nu核酸适配体为cnudx+y+1在已有线性适配体nu172结构和序列上改进得到，所述nu172的序列如seq id no:1所示。
8、其中，seq id no:1单链核酸：cgcctaggttgggtagggtggtggcg。
9、其中，α-凝血酶环状nu核酸适配体cnud2对应待环化适配体nud2和双发夹辅助链nuc2制得的α-凝血酶环状nu核酸适配体。
10、α-凝血酶环状nu核酸适配体cnud4对应待环化适配体nud4和双发夹辅助链nuc4制得的α-凝血酶环状nu核酸适配体。
11、α-凝血酶环状nu核酸适配体cnud6对应待环化适配体nud6和双发夹辅助链nuc6制得的α-凝血酶环状nu核酸适配体。
12、α-凝血酶环状nu核酸适配体cnud8对应待环化适配体nud8和双发夹辅助链nuc8制得的α-凝血酶环状nu核酸适配体。
13、α-凝血酶环状nu核酸适配体cnud10对应待环化适配体nud10和双发夹辅助链nuc10制得的α-凝血酶环状nu核酸适配体。α-凝血酶环状nu核酸适配体的制备方法，包括以下步骤：
14、s1、将待环化适配体与双发夹辅助链混合退火处理，得到第一混合溶液；
15、s2、向第一混合溶液中加入t4连接酶，在第一温度条件下反应，得到第二混合溶液；
16、s3、将第二混合溶液在第二温度条件下浓缩，然后加入甘油和甲酰胺混合溶解，得到第三混合溶液；
17、s4、将第三混合溶液进行凝胶电泳纯化，得到α-凝血酶环状nu核酸适配体。
18、根据上述技术手段，通过采用t4连接酶与合理设计的待环化适配体和双发夹dna辅助链进行混合反应，以生成内源性磷酸二酯键的方式将两种线性适配体核酸序列的末端碱基连接，从而构建封闭的环状核酸骨架，即α-凝血酶环状nu核酸适配体，其相比于线性适配体具有有更高的热稳定性与血液半衰期，以及在正常生理条件下对α-凝血酶更高的亲和力。
19、优选的，所述s1中，待环化适配体二级结构中含有四个t碱基的发夹结构，所述发夹结构包括含有1～10对碱基对。
20、优选的，所述s1中，双发夹辅助链二级结构中均含有两个发夹结构，所述发夹结构与所述待环化适配体互补区域的序列长度为十二个碱基。
21、优选的，所述s1中，待环化适配体为nudx+y+1；x+y+1表示发夹中的茎的碱基对个数，x+y+1的取值范围为1～10；
22、所述nudx+y+1的核苷酸序列如seq id no:16所示。
23、其中，seq id no:16单链核酸：
24、phosphate(n)xtttt(n’)x(n)yctaggttgggtagggtggtg(n’)y；x的取值范围为0～5之间的整数，y的取值范围为0～4之间的整数；n和n’对应a、t、c、g中的任意碱基；(n)x和(n)y分别与(n’)x和(n’)y互补配对，phosphate表示该序列5'端修饰了磷酸基团。
25、待环化适配体nudx+y+1表示该待环化适配体二级结构中含有发夹结构，包括tttt的环和1～10对碱基的茎。
26、优选的，所述s1中，当x+y+1的取值为2、4、6、8和10时，待环化适配体nud2表示该待环化适配体二级结构中含有四个t碱基的发夹结构，发夹中的茎的碱基对为两个。待环化适配体nud2的核苷酸序列如seq id no:2所示。
27、待环化适配体nud4表示该待环化适配体二级结构中含有四个t碱基的发夹结构，发夹中的茎的碱基对为四个。待环化适配体nud4的核苷酸序列如seq id no:3所示。
28、待环化适配体nud6表示该待环化适配体二级结构中含有四个t碱基的发夹结构，发夹中的茎的碱基对为六个。待环化适配体nud6的核苷酸序列如seq id no:4所示。
29、待环化适配体nud8表示该待环化适配体二级结构中含有四个t碱基的发夹结构，发夹中的茎的碱基对为八个。待环化适配体nud8的核苷酸序列如seq id no:5所示。
30、待环化适配体nud10表示该待环化适配体二级结构中含有四个t碱基的发夹结构，发夹中的茎的碱基对为十个。待环化适配体nud10的核苷酸序列如s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.α-凝血酶环状NU核酸适配体，其特征在于，所述α-凝血酶环状NU核酸适配体为cNUDx+y+1；
2.如权利要求1所述的α-凝血酶环状NU核酸适配体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状NU核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述S1中，待环化适配体二级结构中含有四个T碱基的发夹结构，所述发夹结构包括含有两对碱基对、四对碱基对和六对碱基对；
4.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状NU核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述S1中，待环化适配体为NUDx+y+1；
5.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状NU核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述S1中，双发夹辅助链为NUCx+y+1；
6.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状NU核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述S1中，退火处理的缓冲液为40 mM三羟甲基氨基甲烷，1.5 mM 氯化镁，5 mM 氯化钾和140 mM氯化钠，缓冲液的pH值为7.4；
7.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状NU核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述S1中，待环化适配体与双发夹辅助链的摩尔比为1:1~1:2；
8.一种如权利要求1所述的α-凝血酶环状NU核酸适配体的解毒剂，其特征在于，所述解毒剂为antiNUDx+y+1；
9.一种如权利要求2至权利要求7任一项所述制备方法制得的α-凝血酶环状NU核酸适配体的应用，其特征在于，所述α-凝血酶环状NU核酸适配体在制备抑制凝血制剂中的应用。
10.一种如权利要求1所述α-凝血酶环状NU核酸适配体的解毒剂的应用，其特征在于，所述解毒剂在恢复凝血中的应用。
...
【技术特征摘要】
1.α-凝血酶环状nu核酸适配体，其特征在于，所述α-凝血酶环状nu核酸适配体为cnudx+y+1；
2.如权利要求1所述的α-凝血酶环状nu核酸适配体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状nu核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述s1中，待环化适配体二级结构中含有四个t碱基的发夹结构，所述发夹结构包括含有两对碱基对、四对碱基对和六对碱基对；
4.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状nu核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述s1中，待环化适配体为nudx+y+1；
5.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状nu核酸适配体的制备方法，其特征在于，所述s1中，双发夹辅助链为nucx+y+1；
6.根据权利要求2所述的α-凝血酶环状nu核酸适配体的制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：左华，张哲，陈彦曦，高志伟，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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