【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体为一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法。
技术介绍
1、血管性血友病（von willebrand disease, vwd）是一种由患者血管性血友病因子（von willebrand factor，vwf）基因突变而导致的常染色体显性遗传疾病。vwf的数量减少，结构或功能异常均会导致vwd。根据vwf的发病机制及临床表现的轻重，vwd被分为：1型vwd、2型vwd和3型vwd。3型是vwd中最严重的类型，发病率约为0.5~1/100万，其病人血浆当中的vwf完全或几乎完全缺失，结构和功能大多也存在异常，这会导致严重的出血现象，甚至造成自发性关节出血，肌肉出血及内脏出血，严重时威胁病人的生命。研究3型vwd的分子发病机制，有助于了解vwf蛋白的结构与功能的关系，对于临床诊断、治疗和预后都有重要意义。
2、鉴于此，我们提出了一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，所述方法包括如下步骤：
3、s1、采血以及实验室诊断；
4、s2、vwf多聚化分析；
5、s3、突变筛查；
6、s4、质粒构建；
7、s5、重组vwf蛋白的细胞表
8、s6、数据检测整理。
9、可选的，所述s1进一步包括：
10、静脉采血，使用3.2%柠檬酸钠按1：9比例抗凝；
11、将全血4000g离心10分钟得到血浆；
12、vwf：ag通过 elisa法测定；
13、使用10 mg/l vwf单抗包被孔板，并用3％bsa-pbs封闭2小时；
14、用pbs-tween20洗板三次后，加入用0.5%bsa-pbs稀释的正常混合血浆和待测血浆；
15、用pbs-tween20洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的sz-34，37℃孵育2小时；
16、洗板五次，加入底物缓冲液1 mg/ml邻苯二胺和0.03% 过氧化氢，室温5分钟后加入0.05 ml 3m 硫酸终止反应，室温放置10分钟后测定492nm的吸光度；
17、将50人份正常混合血浆的vwf：ag含量定为1000u/l，并以此血浆作为标准曲线来计算各待测血浆的vwf：ag含量。
18、可选的，所述s2进一步包括：
19、病人血浆使用上样缓冲液按1：5比例进行稀释，60℃加热 30分钟；
20、在3ma恒流下，使用1.5% sds-琼脂糖胶电泳分离vwf多聚体10小时，随后将琼脂糖胶水洗，风干，以及使用5%脱脂奶粉包被1小时，最后使用兔抗人vwf一抗和羊抗兔荧光二抗检测vwf多聚体；
21、可选的，所述s3进一步包括：
22、将先证者血细胞针对遗传性出血性疾病相关基因进行二代测序；
23、针对二代测序发现的vwf基因的两个突变，用一代测序对先证者外周血细胞dna进行验证，其中对vwf基因的第28号外显子和第51号外显子分别设计引物如下：
24、vwf-6059034-f： 5’-ggataggtatccgaacacggag-3’；
25、vwf-6,059,034-r： 5’- acaagagggttgctttagccat-3’；
26、vwf-6,128,770-f： 5’- cagctctgacggtcgcttc-3’；
27、vwf-6,128,770-r： 5’-tctgtgggaatatggaagtcattg-3’。
28、pcr反应体系（25μl）：dntp 2μl，10×ex tap buffer 2.5μl，extap enzyme 0.2μl，primer f 1μl，primer r 1μl，dna或cdna 1μl，ddh2o 17.5μl；
29、pcr扩增条件：95℃预变性3分钟；94℃变性 30秒，55～60℃退火 35秒，72℃延伸40～50秒，35个循环后72℃修复延伸5～8分钟；pcr产物纯化回收进行测序分析。
30、可选的，所述s4进一步包括：
31、包含野生型人源vwf全长cdna序列的表达载体psvhvwf；
32、在质粒基础上，使用基于pcr定点突变法将vwf 8171位g突变为a；
33、pcr引物序列为：5’-gtgaggagcctgagtacaacgacatcactgc-3’；
34、pcr反应体系（25μl）：5×hf buffer 5μl，10 mm dntp 0.5 μl，10 mm primer 1μl，dna 1μl (50 ng），phusion dna polymerase 0.3 μl，ddh2o 16.2 μl；
35、pcr扩增条件：98℃预变性30秒；98℃变性 10秒，65℃退火 30秒，72℃延伸10分钟，22个循环后72℃修复延伸15分钟；
36、pcr产物经dpn i酶37℃消化3小时后，热激法转入dh5α感受态细胞，提取质粒并进行测序分析。
37、可选的，所述s5进一步包括：
38、hek-293t细胞使用含10%胎牛血清的dmem高糖培养基培养；
39、细胞培养于6孔板，当铺满总面积的50-70%时做转染；
40、将空载质粒、vwf wt质粒、vwf c2724y质粒以及两种质粒混合物转入hek-293t细胞；
41、转染48小时后，收取细胞上清，细胞用pbs清洗后再使用裂解液（100 mm tris/hcl, ph 7.5, 1% triton x-100，并添加pmsf和蛋白酶抑制剂混合物）裂解；
42、细胞上清使用30 kda超离管浓缩至原体积的1/10；
43、裂解液和培养上清做还原（上样缓冲液含β-巯基乙醇）和非还原（上样缓冲液不含β-巯基乙醇）sds聚丙稀酰胺凝胶电泳，转pvdf膜后孵抗vwf抗体做western blot和vwf多聚化分析。
44、可选的，所述s6进一步的包括：
45、s61、先证者血浆vwd表型检测；
46、s62、先证者及其父母血浆vwf多聚体分析；
47、s63、vwf基因突变的测定；
48、s64、vwf c2724y蛋白的表达；
49、s65、vwf c2724y蛋白的多聚体分析。
50、与现有技术相比，本专利技术提供了一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，具备以下有益效果：
51、1、该vwf二聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种VWF二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种VWF二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述S1进一步包括：
3.根据权利要求1所述的一种VWF二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述S2进一步包括：
4.根据权利要求1所述的一种VWF二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述S3进一步包括：
5.根据权利要求1所述的一种VWF二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述S4进一步包括：
6.根据权利要求1所述的一种VWF二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述S5进一步包括：
7.根据权利要求1所述的一种VWF二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述S6进一步的包括：
【技术特征摘要】
1.一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述s1进一步包括：
3.根据权利要求1所述的一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病的改善方法，其特征在于：所述s2进一步包括：
4.根据权利要求1所述的一种vwf二聚体化和分泌障碍血管性血友病...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛志云，张敬宇，郭玉洁，
申请(专利权)人：河北医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：
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