【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于支原体检测，具体涉及基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法。
技术介绍
1、鸡滑液囊支原体（mycoplasma synoviae，ms）是一种介于细菌和病毒之间的微生物，属于支原体属。它没有细胞壁，形态多样，主要呈球形或球杆状，大小约为 0.2-0.4μm，这种微生物能够在鸡的体内生存和繁殖，对鸡的多个组织器官造成损害，导致鸡的死亡率上升，特别是在雏鸡阶段，由于雏鸡抵抗力较弱，感染后病情往往较重，死亡率相对较高；同时，感染鸡的生长发育迟缓，使得鸡达到上市体重的时间延长，增加了饲养成本；对于蛋鸡来说，产蛋性能的下降直接影响了养鸡场的经济效益。而且，这种病原体在鸡群中容易长期存在，难以彻底清除，会持续对鸡群健康和生产造成威胁，因此，需要对种鸡群进行支原体定期检测。
2、鸡滑液囊支原体检测方法包括血清学检测方法、病原体分离培养方法、分子生物学检测方法，分子生物学检测方法中荧光定量 pcr是常见的鸡滑液囊支原体检测方法之一，其具有如下优点：高灵敏度与特异性、定量分析、可重复性好等优点，但是现有技术中荧光定量pcr扩增程序时间较长，从而降低了整体检测效率、增加检测成本、影响结果准确性、降低实验通量、不利于实时监测，最终影响数据的质量和检测分析结果。
技术实现思路
1、针对
技术介绍
提出的问题，本专利技术研究设计了一种基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其目的在于：提供一种缩短荧光定量pcr扩增程序时间、提高鸡滑液囊支原体整体检测效率、
2、本专利技术的技术解决方案：
3、基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，具体包括如下步骤：
4、（一）提取dna
5、采用无菌注射器抽取鸡的关节液至无菌离心管并在微量离心机上进行离心操作，离心后去上清液，并向无菌离心管内沉淀物加dna提取试剂，提取纯净的模板dna，暂时保存备用；
6、（二）反应体系准备
7、在冰盒内依次将预冷好的10μlpcr 预混液、0.8-2μl浓度为1μmoll的pcr 引物、0.2-1μl浓度为0.5μmoll的pcr 探针、1-5μl模板dna、1-3μl双蒸水加入洁净的 pcr 管中，边加边混匀后，制得反应体系，置于冰盒中暂存待用；
8、（三）设置并运行反应程序
9、将步骤（二）中配制好反应体系的 pcr 管离心后放入荧光定量 pcr 仪中，设定pcr反应程序：95℃预变性20s；95℃变性1s，60℃退火20s，40个循环；
10、（四）测试结果与判定
11、 pcr 仪采集上述循环的荧光信号，并绘制扩增曲线，设置阳性与阴性对照进行结果判定。
12、优选的，所述步骤（一）中微量离心机的转速为13500rpm，离心时间为15min，纯净dna暂时保存的温度为-20℃。
13、优选的，所述步骤（一）中dna提取试剂为市场在售的磁珠法 dna 提取试剂盒。
14、优选的，所述步骤（二）中pcr 预混液的体积为10μl，pcr 引物的体积为2μl，pcr探针的体积为1μl，模板dna的体积为5μl、双蒸水的体积为2μl。
15、优选的，所述步骤（二）中pcr 预混液为市售兼容快速程序的animal detection u+ probe master mix。
16、优选的，所述pcr 引物包括1μlpcr 正向引物、1μlpcr 反向引物，pcr 正向引物的序列为ctaaatacaatagcccaaggcaa，pcr 反向引物的序列为cctcctttcttacggagtaca。
17、优选的，所述pcr 探针的序列为5’-fam-agcgatacacaaccgcttttagaat-bhq1-3’。
18、优选的，所述步骤（三）中离心转速为1500rpm，离心时间为2min。
19、本专利技术的有益效果：本专利技术的基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，创造性地将反应体系的pcr反应程序设置为：95℃预变性20s；95℃变性1s，60℃退火20s，40个循环，该程序设置不仅使得鸡滑液囊支原体检测时间比市售试剂盒及行标程序均缩短约40%，节约时间成本，大大提高检测效率，同时本专利技术的检测方法具有灵敏度高、重复性好、检测结果可靠等优点，可用于ms的临床诊断及流行情况的监测。
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1.基于荧光定量PCR对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
2.如权利要求1所述基于荧光定量PCR对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（一）中微量离心机的转速为13500rpm，离心时间为15min，纯净DNA暂时保存的温度为-20℃。
3.如权利要求1所述基于荧光定量PCR对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（一）中DNA提取试剂为市场在售的磁珠法 DNA 提取试剂盒。
4.如权利要求1所述基于荧光定量PCR对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（二）中PCR 预混液的体积为10μL，PCR 引物的体积为2μL，PCR 探针的体积为1μL，模板DNA的体积为5μL、双蒸水的体积为2μL。
5.如权利要求1所述基于荧光定量PCR对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（二）中PCR 预混液为市售兼容快速程序的Animal Detection U+ ProbeMaster Mix。
6.如权利要求1所述基于荧光定量PCR
7.如权利要求1所述基于荧光定量PCR对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述PCR 探针的序列为5’-FAM-AGCGATACACAACCGCTTTTAGAAT-BHQ1-3’。
8.如权利要求1所述基于荧光定量PCR对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（三）中离心转速为1500rpm，离心时间为2min。
...【技术特征摘要】
1.基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
2.如权利要求1所述基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（一）中微量离心机的转速为13500rpm，离心时间为15min，纯净dna暂时保存的温度为-20℃。
3.如权利要求1所述基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（一）中dna提取试剂为市场在售的磁珠法 dna 提取试剂盒。
4.如权利要求1所述基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其特征在于：所述步骤（二）中pcr 预混液的体积为10μl，pcr 引物的体积为2μl，pcr 探针的体积为1μl，模板dna的体积为5μl、双蒸水的体积为2μl。
5.如权利要求1所述基于荧光定量pcr对鸡滑液囊支原体进行快速检测的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：张华，周闯，卜永谦，梁越，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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