【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物检测，具体涉及一种用于克罗诺杆菌lamp检测的靶标基因、引物组及检测方法。
技术介绍
1、克罗诺杆菌属肠杆菌科，为革兰氏阴性、可运动、兼性厌氧的条件性食源性致病菌，广泛的存在于水、土壤等自然环境中，主要的感染途径为婴儿配方奶粉和婴儿辅食，感染主要发生在小于4周龄的新生儿中，可引起新生儿坏死性小肠结肠炎(nec)、菌血症和脑膜炎等，死亡率高达80%，并在一定程度上造成幸存者严重的神经系统损伤等后遗症。
2、目前婴儿配方奶粉和婴儿辅食中克罗诺杆菌的检测主要应用传统的选择性培养法，该方法耗时费力，操作复杂，检测效率低。近年来，新兴的免疫学检测法如酶联免疫吸附测定、免疫荧光检测法又存在成本高、精度低、预处理复杂、自动化困难等缺陷。pcr、qpcr等分子检测技术都需要专门的实验室设备和专业的实验人员，且相对耗时。环介导等温扩增(lamp)是2000年开发的一种新兴的在恒温条件下实现特异核酸片段扩增的分子生物学技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换型dna聚合酶在等温条件(65℃左右) 扩增30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。整个扩增过程简单、便捷、快速、成本低、灵敏度高，可在极短的时间内（<1h）将dna数量扩增至数十亿倍，在动植物病害检测、食品安全检测等领域具有广泛的应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种用于克罗诺杆菌lamp检测的靶标基因、引物组及检测方法，可以实现克罗诺杆菌的快速检测，大幅缩短检测周期，全部操作
2、本专利技术的技术方案是，提供一种用于克罗诺杆菌lamp检测的靶标基因，所述的靶标基因包括以下基因中的任意一种或者几种的组合：
3、选自于阪崎克罗诺杆菌atcc 29544基因组中的 ygcb基因，dna序列如seq id no.1所示；
4、选自于阪崎克罗诺杆菌atcc 29544基因组中的 fimg基因及 nank基因，dna序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示；
5、选自丙二酸盐阳性克罗诺杆菌lmg23,826基因组中的 papd基因及 sthd基因，dna序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示；
6、选自苏黎世克罗诺杆菌z3032基因组中的 phpb基因，dna序列如seq id no.6所示。
7、本专利技术还涉及所述的靶标基因在克罗诺杆菌lamp检测中的应用， ygcb基因用于检测克罗诺杆菌属， fimg基因及 nank基因，用于检测阪崎克罗诺杆菌； papd基因及 sthd基因用于检测丙二酸盐阳性克罗诺杆菌； phpb基因用于检测苏黎世克罗诺杆菌。
8、本专利技术还涉及用于克罗诺杆菌lamp检测的引物组，引物组是上述靶标基因的dna片段序列设计制备的，引物组为一组或多组，一组引物组至少包含正向外侧引物、正向内侧引物、反向外侧引物及反向内侧引物，还包括0~2条环引物，其中引物序列如seq id no.7~39所示：
9、seq id no.1对应的两个外部引物clf3和clb3，两个内部引物clfip和clbip，序列分别如seq id no.7~10所示；
10、seq id no.2对应的两个外部引物slf3和slb3，两个内部引物slfip和slbip，两个环导引物sllf和sllb，序列分别如seq id no.11~16所示；
11、seq id no.3对应的两个外部引物sl-2f3和sl-2b3，两个内部引物sl-2fip和sl-2bip，两个环导引物sl-2lf和sl-2lb，序列分别如seq id no.17~22所示；
12、seq id no.4对应的两个外部引物mlf3和mlb3，两个内部引物mlfip和mlbip，两个环导引物mllf和mllb，序列分别如seq id no.23~28所示；
13、seq id no.5对应的两个外部引物ml-2f3和ml-2b3，两个内部引物ml-2fip和ml-2bip，两个环导引物ml-2lf和ml-2lb，序列分别如seq id no.29~34所示；
14、seq id no.6对应的两个外部引物tlf3和tlb3，两个内部引物tlfip和tlbip，1个环导引物tllb，序列分别如seq id no.35~39所示。
15、本专利技术还涉及所述的引物组在克罗诺杆菌lamp检测中的应用，引物clf3、clb3、clfip和clbip用于检测克罗诺杆菌属特异性基因 ygcb；引物slf3、slb3、slfip、slbip、sllf和sllb用于检测阪崎克罗诺杆菌特异性基因 fimg；引物sl-2f3、sl-2b3、sl-2fip、sl-2bip、sl-2lf和sl-2lb用于检测阪崎克罗诺杆菌特异性基因 nank；引物mlf3、mlb3、mlfip、mlbip、mllf和mllb用于检测丙二酸盐阳性克罗诺杆菌特异性基因 papd，引物ml-2f3、ml-2b3、ml-2fip、ml-2bip、ml-2lf和ml-2lb用于检测丙二酸盐阳性克罗诺杆菌特异性基因 sthd；引物tlf3、tlb3、tlfip、tlbip和tllb用于检测苏黎世克罗诺杆菌特异性基因 phpb。
16、进一步优选的实施例中，所述引物组中各引物的浓度均为200 nm。
17、本专利技术还涉及一种克罗诺杆菌lamp检测方法，包括以下步骤：
18、s1、根据上述靶标基因设计并制备上述引物组；
19、s2、利用s1的引物组制备lamp检测体系，lamp反应混合液成分如下：
20、
21、s3、制备待检测样品的基因组dna，加入s2中的lamp检测体系，置于pcr仪或恒温水浴锅中进行循环运行；
22、s4、扩增结束后将阳性样本置于uv灯下拍照分析，或将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
23、进一步优选的实施例中，s2中引物组制备时，将靶标基因序列导入引物设计网页lamp primer designing software primerexplorer中，设定参数并运行程序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于克罗诺杆菌LAMP检测的靶标基因，其特征在于，所述的靶标基因包括以下基因中的任意一种或几种：
2.权利要求1所述的靶标基因在克罗诺杆菌LAMP检测中的应用，其特征在于：ygcB基因用于检测克罗诺杆菌属，fimG基因及nanK基因，用于检测阪崎克罗诺杆菌；papD基因及sthD基因用于检测丙二酸盐阳性克罗诺杆菌；phpB基因用于检测苏黎世克罗诺杆菌。
3. 用于克罗诺杆菌LAMP检测的引物组，其特征在于，引物组是根据权利要求1所述靶标基因的DNA片段序列设计制备的，引物组为一组或多组，一组引物组至少包含正向外侧引物、正向内侧引物、反向外侧引物及反向内侧引物，还包括0~2条环引物，其中引物序列如SEQ ID NO.7~39所示：
4.权利要求3所述的引物组在克罗诺杆菌LAMP检测中的应用，其特征在于：引物CLF3、CLB3、CLFIP和CLBIP构成的引物组用于检测克罗诺杆菌属特异性基因ygcB；引物SLF3、SLB3、SLFIP、SLBIP、SLLF和SLLLB构成的引物组用于检测阪崎克罗诺杆菌特异性基因fimG；引物SL-2F3、S
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述引物组中各引物的浓度均为200 nM。
6.一种克罗诺杆菌LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
7. 根据权利要6所述的检测方法，其特征在于：S2中引物组制备时，将靶标基因序列导入引物设计网页LAMP primer designing software PrimerExplorer中，设定参数并运行程序，得到针对克罗诺杆菌属和三个重要致病重的正链和反链共33条特异引物序列SEQ IDNO.7~39。
8. 根据权利要6所述的检测方法，其特征在于：S3中循环参数如下:65℃，30 min。
9.权利要求6~8任意一项所述检测方法在含克罗诺杆菌的食物、环境样本检测、临床样本检测和/或流行病学监测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于克罗诺杆菌lamp检测的靶标基因，其特征在于，所述的靶标基因包括以下基因中的任意一种或几种：
2.权利要求1所述的靶标基因在克罗诺杆菌lamp检测中的应用，其特征在于：ygcb基因用于检测克罗诺杆菌属，fimg基因及nank基因，用于检测阪崎克罗诺杆菌；papd基因及sthd基因用于检测丙二酸盐阳性克罗诺杆菌；phpb基因用于检测苏黎世克罗诺杆菌。
3. 用于克罗诺杆菌lamp检测的引物组，其特征在于，引物组是根据权利要求1所述靶标基因的dna片段序列设计制备的，引物组为一组或多组，一组引物组至少包含正向外侧引物、正向内侧引物、反向外侧引物及反向内侧引物，还包括0~2条环引物，其中引物序列如seq id no.7~39所示：
4.权利要求3所述的引物组在克罗诺杆菌lamp检测中的应用，其特征在于：引物clf3、clb3、clfip和clbip构成的引物组用于检测克罗诺杆菌属特异性基因ygcb；引物slf3、slb3、slfip、slbip、sllf和slllb构成的引物组用于检测阪崎克罗诺杆菌特异性基因fimg；引物sl-2f3、sl-2b3、sl-2fip、sl-2bip、sl-2lf和sl-2lb构成的引物组用于检测阪崎克罗诺杆菌特异性基因nank；...
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