【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，具体涉及一种可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
1、大头金蝇(chrysomya megacephala)是死亡现场出现频率最高的，同时也是最先到达的嗜尸性蝇类之一，其种类鉴定的准确度和所需时间直接影响死亡时间推断的精确性和速度。受限于形态学鉴定掌握困难，且对大多数幼虫和蛹无效，法医工作者更多依赖于dna-barcoding分子鉴定。但是分子鉴定依赖实验室pcr设备，且目前常用的dna-barcoding方法需要进行测序和比对工作，鉴定耗时较长。寻找一种速度快、准确度高、能可视化，且具有现场应用价值的大头金蝇种类鉴定技术十分必要。
2、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,rpa)是一种恒温核酸扩增技术，无需复杂设备即可在37℃～42℃完成指数级扩增，为基于分子手段的物种鉴定提供了新思路。与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,lfd)结合能实现裸眼可视化检测，非常适用于现场的检测和分析。因此，本方法基于重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸可视化方法(rpa-lfd)，建立了大头金蝇简单、快速、高特异性和灵敏度的种类鉴定方法，可以促进法医昆虫学证据的基层推广应用。
技术实现思路
1、鉴于目前存在的上述不足，本专利技术提供一种可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd引物、探针、试剂盒及方法，具有快速、简单、准确等优点。
3、第一方面，本专利技术提供了一对可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd的引物，所述引物的核苷酸序列为：
4、如seq id no：1所示的正向引物；其中，所述正向引物为：5'-taccatttattgttctagctgcacgtcgt-3'；
5、如seq id no：2所述的反向引物；其中，所述反向引物为：5'-[biotin]-ttgaatatgaactggagtaactaaaggatt-3'；
6、第二个方面，本专利技术提供了一对可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd的探针，所述探针的核苷酸序列为：
7、所述探针的核苷酸序列为：
8、如seq id no：3所述的探针；其中，所述探针为：5'-[fam]-attttattagtattaattaatccttacttac[tnf]ttggtgaccctg ataat-[c3spacer]-3'。
9、第三个方面，本专利技术还提供了前述的引物及探针的组合。
10、第四个方面，本专利技术还提供了一种可视化快速检测大头金蝇的rp a-lfd试剂盒，所述试剂盒保护前述的引物和探针。
11、进一步地，所述试剂盒还包括rpa扩增反应体系试剂。
12、进一步地，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
13、第五个方面，本专利技术还提供了一种非诊断目的的大头金蝇的rpa-lfd可视化快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
14、(1)提取待测样本的dna；
15、(2)以步骤(1)提取的dna为模板，利用权利要求4～6任一所述的试剂盒进行rpa-lfd反应，得到rpa双标记扩增子；
16、(3)应用侧流层析试纸条对步骤(2)中的rpa双标记扩增子进行可视化结果判定。
17、进一步地，所述rpa双标记扩增子为带有fam和biotin双标记的扩增子。
18、进一步地，所述侧流层析试剂条的检测方法为：用去离子水将所述rpa双标记扩增子进行40倍稀释后混匀，滴入侧流层析试纸加样孔中，室温静置，5min内观察结果。
19、本专利技术的有益效果：
20、本专利技术基于cytb基因联合使用rpa和lfd技术，构建了快速、准确的大头金蝇种类鉴定可视化检测体系。体系包括检测大头金蝇的引物对、探针，在37℃条件下仅需15min即可完成扩增，具有良好的特异性，灵敏度达7.8×10-4ng，对案件中的大头金蝇样本的阳性检出率达100％。使用lfd进行可视化，检测结果可在3min稳定读取，简单且直观。总的来说，本专利技术可在20min内，实现从获得样本dna到可视化检出结果的全过程。
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1.一种可视化快速检测大头金蝇的RPA-LFD的引物和探针的组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
2.一种可视化快速检测大头金蝇的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的可视化快速检测大头金蝇的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA扩增反应体系试剂。
4.根据权利要求2所述的可视化快速检测大头金蝇的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
5.一种非诊断目的的大头金蝇的RPA-LFD可视化快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的大头金蝇的RPA-LFD可视化快速检测方法，其特征在于，所述RPA双标记扩增子为带有FAM和Biotin双标记的扩增子。
7.根据权利要求5所述的大头金蝇的RPA-LFD可视化快速检测方法，其特征在于，所述侧流层析试剂条的检测方法为：用去离子水将所述RPA双标记扩增子进行40倍稀释后混匀，滴入侧流层析试纸加样孔中，室温静置，5min内观察结果。p>...
【技术特征摘要】
1.一种可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd的引物和探针的组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
2.一种可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括rpa扩增反应体系试剂。
4.根据权利要求2所述的可视化快速检测大头金蝇的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。
【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚东，杨凤芹，文丹，唐萱，叶承鑫，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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