【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，具体涉及一种吡咯赖氨酰-trna合成酶突变体及其应用。
技术介绍
1、氨酰trna合成酶是蛋白质翻译过程中至关重要的酶。它在细胞内执行两个催化步骤：首先，它催化atp的磷酸基团与氨基酸的羧基结合，生成氨酰-amp；其次，它结合trna，催化氨酰-amp中的氨基酸转移到trna上，从而形成氨酰-trna参与蛋白质肽链的延长。吡咯赖氨酰-trna合成酶(pylrs)是基因密码扩展技术中常用的酶之一，其能够催化具有不同侧链基团的氨基酸与正交的trna结合，随后氨酰-trna识别空白的终止密码子uag，并在核糖体合成肽链的过程中引入这些不同侧链基团的氨基酸。
2、改造pylrs以提高其活性和特异性是当前研究的热点。通过定向进化等手段，科学家们致力于提升pylrs的催化效率和对不同非天然氨基酸(ncaas)的识别能力。这样的改造不仅能够扩大ncaa在蛋白质研究中的应用范围，还可以降低工业生产成本，推动基因密码扩展技术在生物制药等领域的应用。此外，优化后的pylrs在合成生物学、蛋白质工程等领域也将发挥更大的作用，促进新型蛋白质药物和功能性蛋白质的开发。
3、目前报道的pylrs种类有mmpylrs、mbpylrs、mapylrs以及chpylrs等，不同的pylrs的发现为在蛋白质内实现引入更多的非天然氨基酸和更高的引入效率提供了可能，但在实际应用中这些pylrs仍表现了较低的非天然氨基酸引入效率，比如mmpylrs、mbpylrs和chpylrs对高亲和力底物bock的引入效率仅有野生型蛋白
4、综上所述，pylrs的改造有助于克服其当前活性较差的限制，显著提升ncaa的引入效率和重组蛋白的表达量，推动基因密码扩展技术在各个领域的广泛应用。
技术实现思路
1、为了提高吡咯赖氨酰-trna合成酶(pylrs)对不同种类非天然氨基酸的引入效率，本专利技术提供了一种吡咯赖氨酰-trna合成酶突变体及其应用，该突变体可以大幅度提高各类非天然氨基酸(ncaa)在蛋白质中的引入效率。
2、本专利技术提供一种吡咯赖氨酰-trna合成酶突变体，以吡咯赖氨酰-trna合成酶的氨基酸序列为基准，所述突变体包括如下突变中的一种或多种：
3、第2位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第31位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第56位的苏氨酸突变为脯氨酸，第61位的精氨酸突变为赖氨酸，第62位的组氨酸突变为酪氨酸，第122位的苏氨酸突变为丝氨酸和第193位的丝氨酸突变为精氨酸；
4、所述吡咯赖氨酰-trna合成酶的氨基酸序列包含如seq id no.1所示序列。
5、在某些实施方式中，所述吡咯赖氨酰-trna合成酶的核苷酸序列包含如seq idno.2所示序列。
6、在某些实施方式中，所述吡咯赖氨酰-trna合成酶来源于马氏甲烷八叠球菌(methanosarcina mazei)。
7、在某些实施方式中，所述突变体还包括a1)-a5)中的一种或多种：
8、a1)第7位的天冬酰胺突变为酪氨酸；
9、a2)第63位的组氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；
10、a3)第67位的赖氨酸突变为天冬酰胺；
11、a4)第74位的缬氨酸突变为色氨酸或苯丙氨酸；
12、a5)第76位的天冬氨酸突变为天冬酰胺或组氨酸。
13、优选的，所述突变体包含上述所述突变中的3种以上组合。
14、进一步的，所述突变体包含4种突变，为：第7位的天冬酰胺突变为酪氨酸、第63位的组氨酸突变为亮氨酸，第67位的赖氨酸突变为天冬酰胺和第74位的缬氨酸突变为色氨酸。
15、进一步的，所述突变体包含5种突变，为：第7位的天冬酰胺突变为酪氨酸、第63位的组氨酸突变为亮氨酸、第67位的赖氨酸突变为天冬酰胺、第74位的缬氨酸突变为色氨酸和第76位的天冬氨酸突变为天冬酰胺。
16、进一步的，所述突变体包含5种突变，为：第7位的天冬酰胺突变为酪氨酸、第63位的组氨酸突变为亮氨酸、第67位的赖氨酸突变为天冬酰胺、第74位的缬氨酸突变为色氨酸和第76位的天冬氨酸突变为组氨酸。
17、进一步的，所述突变体包含4种突变，为：第7位的天冬酰胺突变为酪氨酸、第63位的组氨酸突变为异亮氨酸、第67位的赖氨酸突变为天冬酰胺和第74位的缬氨酸突变为苯丙氨酸。
18、本专利技术将mmpylrs的结构域分成trna结合结构域(tbd)和c端结构域(cd)，并对mmpylrs的c端突变体ifrs(n346s/c348i)的tbd区域进行改造，通过ifrs对3-溴-苯丙氨酸(3brf)引入到gfp蛋白后的相对荧光强度表示突变体的活性。
19、本专利技术通过对多个氨基酸突变进行组合，构建并获得了组合突变体，使得吡咯赖氨酰-trna合成酶对非天然氨基酸的催化活性大幅提高。
20、本专利技术还提供一种分离的多核苷酸，编码如上文所述的吡咯赖氨酰-trna合成酶突变体。
21、在某些实施方式中，所述多核苷酸的序列包含seq id no.4、seq id no.6、seq idno.8和seq id no.10所示序列中的一种或多种。
22、突变体z1-ifrs、z2-ifrs、z3-ifrs、z4-ifrs的核苷酸序列分别如seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10所示。
23、本专利技术还提供一种核酸构建体，包含如上文所述的多核苷酸。
24、本专利技术还提供一种宿主，包含如上文所述的核酸构建体或基因中整合有如上文所述的多核苷酸。
25、在某些实施方式中，所述宿主选自大肠杆菌dh10b。宿主可以选自bl21(de3)、c321.δa.exp(一种改造过的确实rf-1基因的菌株，来源于bl21)、dh10b。比较常见的是在dh10b中表达。
26、本专利技术还提供如上文所述突变体或如上文所述多核苷酸或如上文所述核酸构建体或如上文所述宿主在生产非天然氨基酸中的应用。
27、在某些实施方式中，所述应用包括：将所述重组载体与目标蛋白质粒共转化至感受态细胞中进行诱导培养，得到含非天然氨基酸的目标蛋白。
28、在某些实施方式中，所述非天然氨基酸选自3-溴-l-苯丙氨酸(3brf)、3-氟-l-苯丙氨酸(3ff)、2，3-氟-l-苯丙氨酸(23ff)、2，4-氟-l-苯丙氨酸(24ff)、2,5-氟-l-苯丙氨酸(25本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体，其特征在于，以吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列为基准，所述突变体包括如下突变中的一种或多种：
2.如权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体还包括A1)-A5)突变中的一种或多种：
3.如权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体还包括如下突变中的一种或多种：
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1-3任一项所述吡咯赖氨酰-tRNA合成酶突变体。
5.如权利要求4所述多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列选自SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示序列中的一种或多种。
6.一种核酸构建体，其特征在于，包含如权利要求4或5所述多核苷酸。
7.一种宿主，其特征在于，包含如权利要求6所述核酸构建体或基因中整合有如权利要求4或5所述多核苷酸。
8.如权利要求1所述突变体或如权利要求4所述多核苷酸或如权利要求6所述核酸构建体或如权利要求7所述宿主在生产非天然氨基酸中的应用。<...
【技术特征摘要】
1.一种吡咯赖氨酰-trna合成酶突变体，其特征在于，以吡咯赖氨酰-trna合成酶的氨基酸序列为基准，所述突变体包括如下突变中的一种或多种：
2.如权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体还包括a1)-a5)突变中的一种或多种：
3.如权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体还包括如下突变中的一种或多种：
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1-3任一项所述吡咯赖氨酰-trna合成酶突变体。
5.如权利要求4所述多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列选自seq idno.4、seq id no.6、s...
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