【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米生物医用领域，包含基于肿瘤微环境响应性纳米凝胶载体的构建及其体内蛋白质的递送。。
技术介绍
1、癌症在我国乃至世界范围内都是人类健康的主要敌人，其发病率也在日益增加。目前常用的癌症治疗方法并不能提供令人满意的治疗效果，且存在特异性低、毒副作用强、复发率高等缺陷。早期的癌症难以发现 ，而癌细胞又易通过淋巴血管等途径转移扩散 ，导致癌症的治愈居高不下。目前临床癌症的治疗方法是手术治疗、放射治疗和化学治疗。然而，手术治疗存在高风险、创伤面积大和易复发的缺点 ；放疗和化疗在杀死癌细胞的同时会损伤机体的正常细胞 ，导致正常生理功能受损。因此 ，人类急需开发新型的癌症诊疗策略攻克这一医学难题。
2、近年来，用于治疗许多人类疾病（包括恶性肿瘤和心血管疾病）的临床翻译的蛋白质疗法越来越多，引起了人们的极大关注。这种治疗性蛋白一般安全无毒，具有良好的特异性和优异的抗肿瘤功效。然而，它们也有一些缺点，如体内外稳定性差、血液半衰期短、酶降解、非靶向细胞毒性和细胞下渗透性。为了提高凋亡蛋白对癌症的治疗效率，从聚合物胶束到各种纳米载体，多聚体，脂质体，纳米凝胶 ，到水凝胶。为克服细胞色素、赫塞汀、凋亡素和蓖麻毒素等凋亡蛋白在细胞内转运的障碍，进行了设计和探索。这些用于细胞内传递凋亡蛋白的纳米系统显示出更长的血浆半衰期、更好的细胞选择性和优越的抗肿瘤能力。
3、纳米载体用于药物对实体肿瘤的体外靶向是一种很有前途的工具，可以实现更稳定和长效的制剂。纳米医学因其体积小、药物毒性小、药物缓释、生物分布方便等优点而成为一个
技术实现思路
1、本专利技术针对蛋白质治疗在癌症治疗中的局限性，如无法靶向释放、失活时间短和膜渗透性差等问题，提供了一种新型紫外光交联纳米凝胶载体制备方法。这一新型纳米凝胶载体通过紫外光进行交联并使用细胞色素c进行蛋白质治疗，具有良好的生物安全性和高抗肿瘤效率。本新型紫外光交联纳米凝胶载体具有以下几种特点：
2、溶酶体逃逸能力：一般纳米粒子通过内吞作用进入细胞后，会通过溶酶体转运途径降解，从而失去原有的功能。为了防止这种现象，该纳米凝胶成功接枝二乙烯三胺避免被溶酶体降解并成功逃逸到细胞质中。
3、血液循环与靶向性: 甲氧基聚乙二醇氨基的存在可以延长纳米凝胶在血液中的循环时间，并减少血液蛋白的吸附，从而提高其靶向性。
4、药物输送与释放: 透明质酸作为壳层聚合物的骨架，可以靶向肿瘤细胞表面的cd44受体，增强肿瘤细胞对该纳米粒子的胞吞。细胞色素c作为载体内的有效成分，可以在达到肿瘤细胞后，由于肿瘤微环境的特殊性（如低ph、高还原性等），实现有针对性的药物释放。
5、响应性: 由于包含胱胺基团二硫键，这些纳米凝胶具有优越的肿瘤微环境响应性，可以在接触肿瘤细胞并受肿瘤微环境影响后，纳米凝胶会迅速降解并释放出蛋白质治疗药物。
6、为了实现以上要求，本专利技术采用了以下技术方案，所述的一种新型紫外光交联纳米凝胶载体制备方法步骤如下：
7、a、聚合物配体1合成过程：
8、(1)将透明质酸(ha)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc·hcl)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)共同溶解于15~30 ml去离子水中，其中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量相同，透明质酸和二者任一的摩尔量的比例可以为1:1.2~1.4。去离子水溶剂中edc和nhs的浓度范围在0.5~3 mg/ml。在30℃的氮气保护环境中反应2 h，来活化ha。
9、(2)将1~2 g的甲氧基聚乙二醇氨基 (平均分子量5000) (mpeg)溶于10~20 ml去离子水中充分溶解后滴加到步骤(1)中，在30℃的氮气保护环境中反应24~48 h，获得聚乙二醇化的透明质酸。
10、(3)将(2)中得到的溶液用注射泵逐滴加入含有二乙烯三胺(diethylenetriamine)的10 ml去离子水溶液中，在30℃的氮气保护环境中反应24~48 h，反应结束后将反应溶液置于截留分子量为3000~8000的透析膜中，用0.01~0.05 mol/l的盐酸溶液透析24~48 h，随后用过量的去离子水透析纯化两到三天，冷冻干燥，得到甲氧基聚乙二醇氨基和二乙烯三胺修饰的透明质酸钠聚合物(ha-g-mpeg/deta)。
11、(4) 将0.15~0.20 g 硫辛酸(dl-α-lipoic acid)和0.13~0.15 g cdi (n，n'-羰基二咪唑)用10~15 ml dmso溶解，在30℃的氮气保护环境中反应2 h 。
12、(5) 取(3)的聚合物0.8~1.0 g加入15 ml去离子水溶解，溶解完成后用注射泵注射进 (4)中的双口烧瓶中，在30℃的氮气保护环境中反应24~48 h，置于截留分子量为3000~8000的透析膜中，之后用过量的去离子水透析纯化48 h，冷冻干燥,最终得到聚合物配体(ha-g-mpeg/deta-c-la)。
13、b、纳米凝胶的制备及负载蛋白质：
14、(6) 称取100 mg聚合物ha-g-mpeg/deta-c-la于烧瓶中，用10~20 ml去离子水溶液溶解，在黑暗条件下用365 nm的紫外光照射一定时间，使其发生交联而形成纳米凝胶。
15、(7) 取100 mg纳米凝胶(nanogel@la)以及cy5标记的细胞色素c(cy5-cc)于烧瓶中，用10~20 ml pbs缓冲溶液溶解，在黑暗条件下用365 nm的紫外光照射反应不同时间，使其在紫外光照射的条件下负载细胞色素c(边光照边负载)。照射完成后将溶液置于截留分子量为30000的透析膜中，用过量去离子水(ph为7~8) 透析纯化20 ~ 24 h，冻干，得到负载细胞色素c的纳米凝胶。
16、2.步骤（1）所述的聚合物1中透明质酸的平均分子质量可以为7000~10000。
17、3.步骤（1）所述的聚合物1中的ha与edc/nhs的摩尔比为1:1.2
18、4.步骤（2）所述的聚合物1中的甲氧基聚乙二醇氨基(mpeg)平均分子量范围为2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型紫外光交联纳米凝胶载体，该制备方法包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种新型紫外光交联纳米凝胶...
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