【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及葡聚糖磷酸化酶突变体，尤其涉及烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶的突变体及其在生物转化淀粉中的应用，属于葡聚糖磷酸化酶突变体及其应用领域。
技术介绍
1、碳水化合物、蛋白质和脂肪是人类饮食中的三种主要营养素，平衡它们的比例对于预防慢性疾病至关重要，如肥胖、ii型糖尿病、心血管疾病、高血压和癌症。良好的饮食结构应包含缓慢代谢的淀粉，这对预防慢性疾病至关重要。
2、纤维素是植物细胞壁的支撑材料，也是地球上最丰富的碳水化合物。全球农业每年产生的木质纤维素生物量约为2000亿吨，纤维素约占40%，每年生产800亿吨纤维素；相比之下，全球谷物年产量约为27亿吨，它含有约75%的淀粉，每年收获20亿吨淀粉作为食物和饲料。因此，作为食物/饲料的年度纤维素资源与淀粉的比例约为40。直链淀粉是通过α-1,4-糖苷键连接的线性葡聚糖，而纤维素是通过β-1,4-糖苷键连接的线性葡聚糖。人类可以消化α-1，4-糖苷键连接的葡聚糖（淀粉），但不能消化β-1，4-糖苷键连接的葡聚糖（纤维素），这是人体内缺乏纤维素水解酶的缘故。将β-1，4-糖苷键连接的葡聚糖酶促生物转化为α-1，4-糖苷键连接的葡聚糖以利用非食品生物质生产淀粉具有应用前景。
3、高效利用农业废弃物资源特别是将纤维素废弃资源高效转化为人造粮食则是缓解粮食危机，实现农业可持续发展的重要途径之一。合成生物技术的快速发展使人们打破自然合成路径，创建高效人工生物合成体系成为可能，也为实现基于木质纤维素原料的人造淀粉高效生物合成提供了强有力的技术保障。
4、
5、纤维素体外无辅酶生物转化为淀粉包括三个步骤：首先，使用不含bg的纤维素酶混合物将纤维素部分水解为纤维二糖；其次，在磷酸盐存在下，cbp将纤维二糖转化为葡萄糖1-磷酸和葡萄糖；第三，来自葡萄糖1-磷酸的一个葡萄糖单元被添加到直链淀粉的非还原端。磷酸盐在cbp和pgp之间循环的反应由pgp催化，这种整合的生物工艺在纤维素向淀粉的生物转化中具有很高的能源效率，并且不会浪费纤维素中的任何葡萄糖单位。然而，目前该系统中酶的使用成本仍较高。如何进一步提高酶元件催化性能，降低酶的生产和使用成本，提高体系的转化效率，将直接决定该技术的产业化可行性。
6、酶元件是体外多酶分子机器生物制造的核心，也是新生物炼制工厂的关键和核心。现有的纤维素制淀粉的关键酶元件不同程度的存在催化效率低、稳定性和适配性差或异源表达难等问题，有待改进。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供是烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突变体；
2、本专利技术的目的之二是提供所述烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突变体的编码基因。
3、本专利技术的目的之三是提供含有所述突变体的编码基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；
4、本专利技术的目的之四是将所述的烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的突变体、其编码基因、含有所述突变体的编码基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞等应用于淀粉的合成或生物转化。
5、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
6、本专利技术的一方面是提供了烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体，该单位点突变体是将氨基酸序列为seq id no.1所示的烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5进行n563t单位点突变所获得的单位点突变体，其氨基酸序列为seqid no.2所示。
7、本专利技术中，所述单位点突变体“n563t”表示将氨基酸序列为seq id no.1所示的烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的第563位氨基酸由天冬酰胺（n）突变成赖氨酸（k）；本专利技术其余的单位点突变的表述依此类推。
8、本专利技术的另一方面是提供了烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体的编码基因。
9、本专利技术的另一方面是含有所述烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体的编码基因的表达盒、重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。
10、本专利技术进一步提供了制备任何一项所述烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体的方法，包括：
11、（1）将所述烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体的编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；
12、（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
13、为了提高所述烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体的表达或纯化效率；优选的，步骤（1）中将烟草来源的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体的编码基因的前端加上一段dockerin序列（agtactaaactatacggcgacgttaatgacgacggcaaagtgaattcaaccgatgcagtggcattaaagcgatacgtcttacgttctggaatatccatcaataccgacaatgccgatctcaacgaagacggtcgggttaatagtaccgaccttggcatactcaagagatacattctgaaagaaatagatactctgccttacaagaat（seq id no.3））后再与表达调控元件连接构建得到重组原核表达载体；含有cbm3（纤维素结合结构域）的蛋白能够由于cbm3对纤维素表面的高亲和力吸附而紧密结合在纤维素表面，所以与纤维素结合上的含cbm3结构域蛋白或复合物可以通过高速离心从水溶液中分离出来。通过实验在大肠杆菌bl21 (de3) 中表达了一种重组蛋白——mini-scaffoldin。合成蛋白mini-scaffoldin包含了一个cbm3结构域和三个不同的结合模块cipa、cbpa和scab。由于结合模块和dockerin之间的高亲和性相互作用，蛋白与mini-scaffoldin可以组装成一个酶复合物，此复合物可以通过mini-scaffoldin的cbm3结构域与再生无定形纤维素（rac）进行较好的吸附，最后通过高本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.α-葡聚糖磷酸化酶5CC5的单位点突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的单位点突变体的编码基因。
3.含有权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
5.一种制备权利要求1所述的α-葡聚糖磷酸化酶5CC5的单位点突变体的方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中将权利要求2所述的编码基因的前端加上一段dockerin序列后再与表达调控元件连接构建得到重组原核表达载体；所述dockerin序列的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述纯化的方法为：将诱导宿主细胞表达的酶粗液产物中加入微晶纤维素后离心，收集沉淀用0.5 mol EDTA重悬后再离心，取上清，即得纯化的蛋白。
8.权利要求1所述的单位点突变体在淀粉的合成或生物转化中的应用。
9.权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组表达
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于包括：以纤维二糖为底物，以权利要求1所述的单位点突变体为转化酶进行酶促生物转化反应得到淀粉；其中，所述的转化酶中还含有纤维素二糖磷酸化酶。
...【技术特征摘要】
1.α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体，其特征在于，其氨基酸序列为seq id no.2所示。
2.权利要求1所述的单位点突变体的编码基因。
3.含有权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
5.一种制备权利要求1所述的α-葡聚糖磷酸化酶5cc5的单位点突变体的方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中将权利要求2所述的编码基因的前端加上一段dockerin序列后再与表达调控元件连接构建得到重组原核表达载体；所述dockerin序列的核苷酸序列为seq id no....
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓青，张伟，田健，徐欣欣，李彦君，姚斌，罗会颖，关菲菲，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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