【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法。
技术介绍
1、昆虫的翅多型现象是表型可塑性最显著的特征之一，这类现象在昆虫中普遍存在。翅多型现象是昆虫适应外界环境条件的策略之一，也是飞行能力和繁殖力之间权衡的结果。了解昆虫的翅二型发育模式差异，有助于揭示昆虫产生翅多型现象的分子机制及其在生物进化过程中的生态学意义，对于农林业害虫的生物防治具有重要理论和实践意义。目前对于昆虫翅型研究主要集中在分子和基因层面，缺乏在细胞类型层面对昆虫翅发育分子机制和演化过程的解析。
2、褐飞虱(nilaparvata lugens(stal))隶属于半翅目、飞虱科，是一种重要的亚洲水稻害虫；始红蝽(pyrrhocoris apterus)属半翅目、红蝽科，二者均具备典型的翅二型现象，是研究昆虫翅型发育模式的优秀模型。昆虫的翅由数百万个高度分化和相互连接的细胞组成，挖掘调节翅发育的关键细胞类型，需要借助单细胞测序技术。获得昆虫翅芽组织的单细胞悬液是实现昆虫翅芽单细胞测序的前提，然而，目前常用于单细胞测序的哺乳动物和昆虫的细胞清洗液和细胞培养基，并不适用于昆虫翅芽，特别是昆虫膜质翅，原因如下：昆虫翅芽细胞脆弱，对ph值和渗透压敏感。常用的细胞清洗液和细胞培养基由于盐离子浓度和渗透压都较低，导致细胞吸水膨胀，从而破坏细胞的完整性，无法达到单细胞测序要求的高细胞存活率。此外，为了确保单细胞测序的成功和准确性，通常使用无钙镁离子的缓冲液制备单细胞悬液，因为钙镁离子可能影响油包水内逆转录体系的反应，从而导致逆转录失败。然而，使用所述缓冲
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：作为第一方面，本专利技术提供一种昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
3、取5龄半翅目昆虫，在1 ml磷酸盐缓冲液（pbs溶液）中解剖得到完整的翅芽组织，置于1 ml低钙镁pbs溶液中，离心；
4、向离心后的翅芽组织中加入1ml蛋白酶溶液在37℃下进行酶解，充分解离至无细胞团块，获得翅芽组织混合物；
5、翅芽组织混合物经30 μm细胞筛过滤后，加入低钙镁pbs溶液以终止酶解，使得过滤后的翅芽组织混合物和低钙镁pbs溶液的总体积为10 ml，离心，收集细胞沉淀物；使用低钙镁pbs溶液清洗细胞沉淀物，离心，获得沉淀，加入1 ml 低钙镁pbs溶液再次重悬，获得翅芽单细胞悬液；
6、其中，所述低钙镁pbs溶液通过以下步骤配置得到：pbs溶液中添加cacl2和mgso4，使得cacl2终浓度为500 mg/l，mgso4终浓度为920 mg/l，渗透压为360 mosm/kg，使用氢氧化钠（naoh）或盐酸（hcl）调节ph值为6.2。
7、进一步地，蛋白酶溶液为胰蛋白酶-edta溶液，含有2.5 g/l胰蛋白酶和0.2 g/ledta，在加入翅芽组织前，进行37℃预热。
8、优选的，所述的翅芽组织离心条件为1.5 ml ep管内，4℃、500rcf（relativecentrifugal force，相对离心力）条件下离心5min。
9、优选的，所述的翅芽组织酶解条件为37℃金属浴，酶解消化5~7min，并用移液枪吹打细胞团块1~2次。
10、进一步地，所述半翅目昆虫为褐飞虱或始红蝽。
11、优选的，所述过滤后的翅芽组织混合物和使用低钙镁pbs溶液清洗后的细胞沉淀物离心条件为15 ml离心管，4℃、300rcf条件下离心5min。
12、作为第二方面，本专利技术提供一种上述制备方法制备得到的昆虫翅芽单细胞悬液。
13、作为第三方面，本专利技术提供一种上述昆虫翅芽单细胞悬液在单细胞测序中的应用。
14、本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供细胞悬液的制备方法，适用于昆虫翅芽组织，特别是使用本专利技术创制的低钙镁pbs溶液对昆虫膜质翅的翅芽组织细胞进行分离，分离的单细胞纯度高，可维持长时间的细胞活性，无成团现象，杂质碎片少，背景干净，分离获得的细胞悬液可直接用于单细胞测序。
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1.一种昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，蛋白酶溶液为胰蛋白酶-EDTA溶液，含有2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA，在加入翅芽组织前，进行37℃预热。
3.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述翅芽组织离心条件为1.5 mL Ep管内，4℃、500RCF条件下离心5min。
4.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述翅芽组织酶解条件为37℃金属浴，酶解消化5~7min，移液枪吹打细胞团块1~2次。
5.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述半翅目昆虫为褐飞虱或始红蝽。
6.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述过滤后的翅芽组织混合物和使用低钙镁PBS溶液清洗后的细胞沉淀物离心条件为15 mL离心管，4℃、300RCF条件下离心5min。
7.一种权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的昆虫翅芽单细胞悬
8.一种权利要求7所述的昆虫翅芽单细胞悬液在单细胞测序中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，蛋白酶溶液为胰蛋白酶-edta溶液，含有2.5 g/l胰蛋白酶和0.2 g/l edta，在加入翅芽组织前，进行37℃预热。
3.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述翅芽组织离心条件为1.5 ml ep管内，4℃、500rcf条件下离心5min。
4.如权利要求1所述的昆虫翅芽单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述翅芽组织酶解条件为37℃金属...
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