【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白纯化，具体涉及一种重组人偏肺病毒融合前f蛋白纯化方法。
技术介绍
1、人偏肺病毒(human metapneumovirus，hmpv)是一种常见的呼吸道病毒，属肺炎病毒科偏肺病毒属，2001年首次发现于荷兰，目前在全球广泛流行，是导致婴幼儿、免疫缺陷者和老年人急性下呼吸道感染的重要病原微生物。在因急性下呼吸道感染住院的婴幼儿中大约6%是由hmpv引起的。
2、尽管目前还没有批准上市的疫苗来预防hmpv感染，但已被fda批准上市的重组rsvf蛋白疫苗（abrysvo、arexvy）为hmpv疫苗开发指明了方向，两者同属于肺炎病毒科，有着相似的结构蛋白和入侵机制。同rsv f蛋白类似，hmpv f蛋白也是机体针对病毒产生中和抗体的主要靶点，以亚稳态“融合前（prefusion）”三聚体状态存在病毒表面，一旦与宿主细胞接触就会经历广泛的构象变化，折叠成能量最优、稳定的“融合后（postfusion）”状态，促进病毒与细胞的融合。与rsv f蛋白不同的是，hmpv f蛋白只有一个弗林蛋白酶位点，酶切后不释放p27肽段。为了稳定hmpv f蛋白胞外域“融合前”构象，对序列主要进行了三个方面改变：（1）hmpv f蛋白c端引入三聚化结构域，如t4噬菌体纤维蛋白(fibritin)分子c-末端的27个残基的结构域；（2）删除弗林蛋白酶位点，引入f2-f1连接子；（3）采取氨基酸替换引入链间二硫键和内部空腔填充，促进hmpv f蛋白维持在融合前状态。可参考guillaume b等人（2021）“interprot
3、因此，亟需开发一种制备均一、纯度高和保持融合前构象的f蛋白纯化方法。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种重组人偏肺病毒融合前f（以下简称hmpvf）蛋白纯化方法。该方法适用于规模化生产，能够得到均一、纯度高、构象稳定的重组人偏肺病毒融合前f蛋白。
2、本专利技术的第一个目的是提供了一种重组人偏肺病毒融合前f蛋白纯化方法，包括如下步骤：
3、p1：利用深层滤器过滤发酵液，得到发酵澄清液；
4、p2：采用羟基磷灰石从发酵澄清液中捕获重组hmpv f蛋白，得到纯化液1；
5、p3：采用低ph法对纯化液1进行病毒灭活，得到灭活液；
6、p4：对灭活液进行阴离子交换层析，得到纯化液2；
7、p5：对纯化液2进行复合弱阴离子层析，得到纯化液3；
8、p6：对纯化液3进行uf/df，得到超滤液；
9、p7：对超滤液进行除病毒纳滤和无菌过滤，得到重组hmpv f蛋白原液。
10、在本专利技术中，选用羟基磷灰石来捕获目的蛋白，可以去除大部分色素、部分核酸和宿主蛋白；再选用强阴离子交换层析去除大部分的宿主蛋白、绝大部分核酸和内毒素；再进一步选用复合弱阴离子层析进一步精纯去除聚集体、少量残留的宿主蛋白、核酸和未被灭活的病毒。
11、在一些实施方式中，所述的羟基磷灰石层析中羟基磷灰石填料是孔径为40、60、80μm的ⅱ型羟基磷灰石（cht ⅱ型）；
12、在一些实施方式中，所述p2步骤具体包括：
13、用磷酸缓冲液（pb缓冲液）平衡cht层析柱至基线平稳；将发酵澄清液电导率用纯化水稀释至小于8.0 ms/cm进行上样；上样结束后，用含有0～70mm nacl的磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用70～500mm nacl的磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液1。
14、在一些实施方式中，所述磷酸缓冲液（pb缓冲液）的浓度为10~30mm，ph6.6~7.0。
15、在一些实施方式中，所述p3步骤具体包括用≤4m的稀盐酸调节纯化液1的ph至≤3.8，18~26℃孵育30~60min，灭活完成后用碱液或tris-hcl将ph调到6.5~7.0，得到所述灭活液；所述碱液为0.1~0.5m naoh；tris-hcl浓度为0.5~1.0m，ph为8.0~9.0。
16、在一些实施方式中，所述的阴离子交换层析中阴离子交换填料为带有季铵基[-ch2-n+(ch3)3]或二乙基氨基乙基[-ch2-ch2-n+-(ch2-ch3)2]功能基团的阴离子交换填料。在一些实施方式中，所述的阴离子交换层析具体包括以下步骤：
17、用磷酸缓冲液（pb缓冲液）平衡阴离子交换层析柱至基线平稳；将灭活液调节电导率不高于9.0ms/cm进行上样；上样结束后，用磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含0～300 mm nacl的磷酸缓冲液线性洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液2。在一些实施方式中，所述磷酸缓冲液（pb缓冲液）的浓度为10~30mm，ph6.6~7.0。
18、在一些实施方式中，所述的复合弱阴离子层析具体包括以下步骤：
19、用磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳；将纯化液p2（电导率≤20 ms/cm）高盐上样至复合弱阴离子层析柱；上样结束后，用含100～200mm nacl的磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含0.5～1.0m nacl的磷酸缓冲液脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液3。
20、在一些实施方式中，所述复合层析中填料为带有苯基缩水甘油醚和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵功能基团的多模式强阴离子填料，如diamond mix a mustang、smac mma或capto adhere。
21、在本专利技术中，通过填料配基上的苯环可做到常规离子交换做不到的高盐上样，因此，上一步样品无需任何处理，可直接高盐上样。
22、在一些实施方式中，所述的uf/df具体包括以下步骤：
23、采用30～50kda超滤膜包对纯化液3进行超滤换液，换液倍数≥6，获得超滤液。
24、在一些实施方式中，所述的除病毒过滤的具体过程如下：将超滤液依次进行经过virosart max预过滤和virosart hf除病毒过滤，再经过无菌过滤后得到重组hmpv f蛋白原液。...
【技术保护点】
1.一种重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述的羟基磷灰石层析中羟基磷灰石填料是孔径为40、60或80μm的Ⅱ型羟基磷灰石。
3. 根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述P2步骤具体包括用磷酸缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱至基线平稳；将发酵澄清液电导率用纯化水稀释至小于8.0 mS/cm进行上样；上样结束后，用0～70mM NaCl的磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用70～500mM NaCl的磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液1。
4.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述P3步骤具体包括用≤4M的稀盐酸调节纯化液1的pH至≤3.8，18~26℃孵育30~60min，灭活完成后用碱液或Tris-HCl将pH调到6.5~7.0，得到所述灭活液；所述碱液为0.1~0.5M NaOH；Tris-HCl浓度为0.5~1.0M，pH为8.0~9.0。
5.
6.根据权利要求5所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析具体包括以下步骤：用磷酸缓冲液平衡阴离子交换层析柱至基线平稳；将灭活液调节电导率不高于9.0mS/cm进行上样；上样结束后，用磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含0～300 mM NaCl的磷酸缓冲液线性洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液2。
7.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述的复合弱阴离子层析具体包括以下步骤：用磷酸缓冲液平衡层析柱至基线平稳；将纯化液P2上样至复合弱阴离子层析柱；上样结束后，用含100～200mM NaCl的磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用含0.5～1.0M NaCl的磷酸缓冲液脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液3。
8.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述的UF/DF具体包括：采用30～50kDa超滤膜包对纯化液3进行超滤换液，换液倍数≥6，获得超滤液。
9.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法，其特征在于，所述的除病毒过滤的具体过程如下：将超滤液依次进行经过Virosart Max预过滤和Virosart HF除病毒过滤；再经过无菌过滤后获得重组hMPV F蛋白原液。
10.根据权利要求1-9任一项所述的重组人偏肺病毒融合前F蛋白纯化方法制备得到的重组hMPV F蛋白原液。
...【技术特征摘要】
1.一种重组人偏肺病毒融合前f蛋白纯化方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前f蛋白纯化方法，其特征在于，所述的羟基磷灰石层析中羟基磷灰石填料是孔径为40、60或80μm的ⅱ型羟基磷灰石。
3. 根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前f蛋白纯化方法，其特征在于，所述p2步骤具体包括用磷酸缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱至基线平稳；将发酵澄清液电导率用纯化水稀释至小于8.0 ms/cm进行上样；上样结束后，用0～70mm nacl的磷酸缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；使用70～500mm nacl的磷酸缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，得到所述纯化液1。
4.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前f蛋白纯化方法，其特征在于，所述p3步骤具体包括用≤4m的稀盐酸调节纯化液1的ph至≤3.8，18~26℃孵育30~60min，灭活完成后用碱液或tris-hcl将ph调到6.5~7.0，得到所述灭活液；所述碱液为0.1~0.5m naoh；tris-hcl浓度为0.5~1.0m，ph为8.0~9.0。
5.根据权利要求1所述的重组人偏肺病毒融合前f蛋白纯化方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析中阴离子交换填料为带有季铵基[-ch2-n+(ch3)3]功能基团的阴离子交换填料。
6.根据权利要求5所述的重组人偏肺病毒融合前f...
【专利技术属性】
技术研发人员：邢超，刘涛，秦耀斌，张强，赵策，刘晓满，付丽丽，杨立宪，
申请(专利权)人：北京华诺泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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