【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物材料，尤其涉及crgd靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法。
技术介绍
1、血管新生是创面愈合的必要环节。然而，糖尿病创面的内皮细胞功能障碍，导致血管新生减少，是其不愈合的关键因素。内皮祖细胞epcs，亦称为内皮前体细胞，具有强大的旁分泌能力。此前认为，epcs主要通过分泌趋化因子和细胞因子调节内皮细胞功能。近年研究发现，epcs还能通过分泌纳米囊泡改善内皮细胞功能，加速糖尿病创面血管新生，可以作为糖尿病创面修复的潜在手段。
2、然而，这类由细胞分泌的天然外泌体在转化应用时存在明显缺陷。一是天然外泌体大多产量极低且不稳定，据报道，基于超高速离心的策略仅能从每毫升细胞上清中收获1-10μg的纳米囊泡。二是天然外泌体分离和纯化步骤繁琐、成本高且周期长。三是天然外泌体性能不稳定，亲本细胞经多次传代后所分泌的纳米囊泡表型和功能可能发生显著改变，降低治疗潜力。因此，急需解决。
3、上述内容仅用于辅助理解本专利技术的技术方案，并不代表承认上述内容是最接近的现有技术。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供crgd靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，该方法提供了一种新颖的具有促血管生成、抗氧化和抗菌的生物递送系统，提升了治疗糖尿病的创面效果。
2、为达到所述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的，crgd靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，制备方法包括以下步骤：
3、s1、制备
4、s11、进行epcs细胞分离、培养、鉴定，
5、s12、进行epcs-nvs的制备，
6、s13、进行epc-nvs的crgd修饰与鉴定；
7、s2、制备adm-fe3+@pa/gelma水凝胶：
8、s21、在ph值等于10的环境中以1：3的摩尔比合成fe3+@原儿茶醛(protocatechualdehyde，pa)溶液；
9、s22、将合车的fe3+@原儿茶醛溶液与adm混合，进行多次离心洗涤后加入配置好的光固化明胶(gelma)前体溶液；
10、s23、通过超声空化使搭载fe3+@pa的adm均匀分散；
11、s24、通过416nm蓝光光照以及adm自组装形成双交联水凝胶。
12、优选的，所述步骤s11中的epcs细胞分离、培养和鉴定包括从大鼠骨髓细胞悬液中分离出epcs，进行原代细胞培养以及传代。
13、优选的，所述步骤s12中进行epcs-nvs的制备过程包括：
14、s12a.用含去外泌体血清的培养基培养原代epcs，并收集细胞上清，采用超速离心法提取epcs的天然外泌体；
15、s12b.将500-1000万/ml的epcs悬液依次通过挤压器的10μm、5μm、1μm孔膜，去除细胞碎片后，获取细胞囊泡悬液，再将悬液进行超速离心，获取epc-nvs。
16、优选的，所述s13中进行epc-nvs的crgd修饰的过程包括：
17、s13a.将deepc-nvs悬浮液与crgd胶束溶液共孵育，尺寸排阻色谱法对crgd修饰的epc-nvs进行纯化，获得crgd@deepc-nvs；
18、s13b.crgd@deepc-nvs的鉴定：进行epcs天然外泌体与epc-nvs的鉴定及比较：透射电子显微镜(transmission electron microscopy,tem)观察两种囊泡的形态和大小；纳米流式(nanoparticle tracking analysis,nta)和动态光散射(dynamic lightscattering,dls)检测两种囊泡的粒径大小和分布；western-blot检测两种囊泡的特异性膜蛋白，如cd9、cd63和cd81；运用zeta电位检测膜电位。
19、本专利技术的有益效果体现在：
20、(1)本专利技术通过挤压的方法制备的内皮祖细胞来源的仿生纳米囊泡，可以作为ev模拟物，将epc内容物输送到伤口。此外，本专利技术将crgd靶向肽偶联到epc-nv表面，可以实现对内皮细胞(endothelial cells,ecs)的主动靶向。此外，还提供了一种双重水凝胶网络，将fe3+@pa络合物修饰的adm与光固化明胶(gelma)结合，以富集和缓释mepc-nv。该水凝胶网络具有抗氧化和抗菌性能，在糖尿病创面中可以降低活性氧水平并且抑制细菌感染，弥补了epc-nv功能的不足。
21、(2)本专利技术根据糖尿病创面细胞摄取能力低、种类复杂的特点，构建了摄取增强、靶向增强的定制化mepc-nv，首次将crgd靶向肽应用到糖尿病创面上，提升了治疗效果。
22、(3)本专利技术构建了adm-fe3+-mnv@pa/gelma靶向递送系统来协同治疗，增强了糖尿病创面的治疗效果。
23、(4)本专利技术采用挤压法可在相同细胞量条件下获得相对天然外泌体5-100倍的囊泡粒子或蛋白量得率，并避免了繁琐的细胞扩增和上清液浓缩等步骤。其次，由于产量的大幅提高，获得等量的纳米囊泡无需亲本细胞多次传代，保证了仿生纳米囊泡的性能稳定性。
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1.cRGD靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的cRGD靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中的EPCs细胞分离、培养和鉴定包括：从大鼠骨髓细胞悬液中分离出EPCs，进行原代细胞培养以及传代。
3.根据权利要求2所述的cRGD靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述步骤S12中进行EPCs-NVs的制备过程包括：
4.根据权利要求3所述的cRGD靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述S13中进行EPC-NVs的cRGD修饰的过程包括：
【技术特征摘要】
1.crgd靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的crgd靶向肽修饰的内皮祖细胞来源仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，所述步骤s11中的epcs细胞分离、培养和鉴定包括：从大鼠骨髓细胞悬液中分离出epcs，进行原代细胞培养以及传代。
【专利技术属性】
技术研发人员：陈振兵，杨小凡，潘昕岩，刘硕媛，万归，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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