【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物和酶工程领域，涉及一系列具有高热稳定性的溶葡萄球菌酶突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、溶葡萄球菌酶(lst)是拟葡萄球菌合成的一种锌离子依赖型的肽酶，其可有效的切割细菌细胞壁肽聚糖交联结构甘氨酸五肽桥中的第2位和第3位甘氨酸形成的肽键，从而起到溶壁杀菌的作用。因此该蛋白具有特异性，可特异性的杀死金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血性葡萄球菌。目前国内、外研究人员利用基因重组技术已将此酶成功表达于多种工程菌中，并且国内已批准溶葡萄球菌酶一批新药临床实验，可应用于医药、美妆、食品、黏膜消毒、口腔护理、私护、兽药、宠物护理等多个领域，具有强大的市场潜力。
2、酶的热稳定性表征酶分子在高温下维持自身结构和活性的能力，是评价酶应用价值的重要标准。热稳定的酶具有提高化学反应速率、简化工艺、降低成本、提高产品质量，活性稳定和耐储藏的优点。所以提高溶葡萄球菌酶的热稳定性一直是科研和生产关注的热点，也是限制其扩大应用场景的重要因素。
3、基于以上背景，本专利技术通过理性设计获得一系列高热稳定性的溶葡萄球菌酶，为后续的生产和扩宽应用场景奠定了基础。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一系列高稳定性的溶葡萄球菌酶突变体，及其制备方法和应用，以解决目前存在的热稳定性问题。
2、为了实现以上目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种高热稳定性的溶葡萄球菌酶突变体，野生型溶葡萄球菌酶的氨基酸序列为seq id n
4、进一步地，所述溶葡萄球菌酶包括不限于seq id no.1所示的序列，还包括截短形式的序列。
5、进一步地，所述包含多个突变位点的突变体优选自以下位点的组合，包括但不局限于以下突变体：k45y/y85f；k45y/n120g；k45y/s190a；y85f/s190a；y85f/s190w；y85f/m131l；y85f/n120g；n120g/s190a；k45y/y85f/n120g；y85f/n120g/s190a；y85f/m131l/s190a；y85f/n120g/m131l。
6、本专利技术还提供了一种上述突变体的表达载体，包括但不局限于pet30a+。
7、本专利技术还提供了一种表达上述突变体的重组菌株。
8、进一步地，所述重组菌株优选大肠杆菌，但不局限于大肠杆菌，还可以是其他的原核细胞或真核细胞。
9、更进一步地，所述真核细胞包括毕赤酵母；所述原核细胞包括乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌和链球菌。
10、本专利技术还提供了上述突变体的制备方法，包括以下步骤：利用定点突变构建突变体表达载体，转入大肠杆菌bl21(de3)感受态中并进行诱导表达。离心收菌超声破碎，取上清经ni柱纯化，超滤管浓缩脱盐。
11、本专利技术还提供了上述突变体、多聚核苷酸分子、重组表达载体、宿主细胞在抗葡萄球菌领域中的应用。
12、进一步地，所述葡萄球菌包括但不限于表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、卢格敦葡萄球菌、腐生葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。
13、有益效果在于，本专利技术基于结构分析，结合多种热稳定性设计软件的系统测试，以溶葡萄球菌酶的热稳定性为指标并以此进行突变体设计，获得了一系列在tm值提高的突变体。其中筛选得到的有益突变体在60℃条件下的酶活损失减少5.8％-37.9％，tm值提高0.3-7.0℃。并且与野生型溶葡萄球菌酶进行活性比较相比，该突变体的酶活基本相当。为后续的存储、运输和扩大应用场景提供了便利。
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1.一种高热稳定性的溶葡萄球菌酶突变体，其特征在于，其是在氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的基础上，存在以下一个或多个突变位点：K45Y、Y85F、N120G、M131L、S190A和S190W。
2.如权利要求1所述的溶葡萄球菌酶突变体，其特征在于，所述突变位点选自以下位点的组合，包括但不局限于以下突变体：K45Y/Y85F；K45Y/N120G；K45Y/S190A；Y85F/S190A；Y85F/S190W；Y85F/M131L；Y85F/N120G；N120G/S190A；K45Y/Y85F/N120G；Y85F/N120G/S190A；Y85F/M131L/S190A；Y85F/N120G/M131L。
3.如权利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突变体的编码核酸。
4.含有如权利要求3所述的编码核酸的表达载体，优选地所述表达载体是原核表达载体，包括但不局限于pET30a+。
5.含有如权利要求3所述的编码核酸或如权利要求4所述的表达载体的重组菌株，具体地，其是真菌或细菌。
6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征
7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述大肠杆菌大肠杆菌BL21（DE3）。
8.如权利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突变体，含有如权利要求3所述的编码核酸，如权利要求4所述的表达载体，如权利要求5或6所述的重组菌株在制备抗葡萄球菌的制品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述葡萄球菌包括但不限于表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、卢格敦葡萄球菌、腐生葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述制品是食品、饲料、洗涤用品、药品、化妆品和医疗器械。
...【技术特征摘要】
1.一种高热稳定性的溶葡萄球菌酶突变体，其特征在于，其是在氨基酸序列为seq idno.1所示的基础上，存在以下一个或多个突变位点：k45y、y85f、n120g、m131l、s190a和s190w。
2.如权利要求1所述的溶葡萄球菌酶突变体，其特征在于，所述突变位点选自以下位点的组合，包括但不局限于以下突变体：k45y/y85f；k45y/n120g；k45y/s190a；y85f/s190a；y85f/s190w；y85f/m131l；y85f/n120g；n120g/s190a；k45y/y85f/n120g；y85f/n120g/s190a；y85f/m131l/s190a；y85f/n120g/m131l。
3.如权利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突变体的编码核酸。
4.含有如权利要求3所述的编码核酸的表达载体，优选地所述表达载体是原核表达载体，包括但不局限于pe...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓云，张晓立，张慧泽，朱铭薇，李华珍，章家泉，
申请(专利权)人：百葵锐深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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