【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶活性增强在生产谷氨酸中的应用。
技术介绍
1、l-谷氨酸，化学名称为α-氨基戊二酸，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，主要用于生产味精、香料、以及用作代盐剂、营养增补剂和生化试剂等，在医药、化工、畜牧等领域应用广泛，因此，l-谷氨酸也是世界上产量最大的氨基酸。
2、当前，l-谷氨酸的工业化大规模生产主要使用微生物发酵法生产，其中，最主要的微生物为谷氨酸棒杆菌。在谷氨酸棒杆菌中，tca循环的中间产物α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下合成l-谷氨酸。作为起始tca循环的乙酰辅酶a的积累对于l-谷氨酸的合成至关重要。琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶(succinyl-coa:acetate coa-transferase，scact，acta基因编码)可以催化琥珀酰辅酶a和乙酸合成乙酰辅酶a(biochemistry,51(42),8422-8434.)，对谷氨酸合成中减少副产物积累以及碳原子回收利用可能有效。目前，尚未有该酶的改造提升l-谷氨酸生产能力的报道。
技术实现思路
1、本专利技术通过对野生型acta的过表达，发现其过表达可以提高谷氨酸棒杆菌l-谷氨酸的产量。同时，经过酶的结构模拟，发现acta的第372位氨基酸残基位于c端辅酶a的结合区，推测该位点可能对结构和功能具有重要的作用，进而对372位氨基酸残基进行了饱和突变，获得了一系列活性增强的突变体，这些突变体以及突变体的过
2、第一方面，本专利技术提供了一种提高的l-谷氨酸生产能力的菌株，所述菌株中琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶活性增强。优选地，所述琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶活性增强是氨基酸序列如seq id no：1所示的多肽的表达增强，或者含有氨基酸序列如seq id no：1所示的多肽的突变体，所述突变体是seq id no：1所示的多肽的372位丝氨酸被半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个取代。
3、更具体地，所述菌株是细菌，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，更具体如谷氨酸棒杆菌atcc 13869、谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc 14067，以及由上述菌株制备的产生l-谷氨酸的突变体或菌株。
4、进一步优选地，所述菌株是在谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869基础上改造获得的菌株，这些改造包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
5、a.编码机械敏感通道蛋白的yggb基因；
6、b.编码磷酸转酮酶的fxpk基因；
7、c.编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；
8、d.编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因；
9、e.编码碳酸酐酶的基因。
10、还优选地，所述l-谷氨酸生产菌株中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
11、d.编码α-酮戊二酸脱氢酶的odha基因；
12、e.编码转录调控基因的amtr基因；
13、f.编码转录抑制子的acnr基因。
14、特别优选地，所述谷氨酸棒杆菌进一步地经过改良，其中的ncgl1221同源基因中引入a111v突变，glta编码基因中引入c361y突变。
15、所述菌株具体通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的dna导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(capo4)沉淀法、氯化钙(cacl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-dmso法。
16、本专利技术所述“菌株”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本专利技术的具有启动子活性的核酸的细胞，导入之后称为重组菌株。换言之，本专利技术可以利用任何菌株，只要其菌株中的生物素蛋白连接酶活性增强。本专利技术的菌株可以是细菌，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌atcc 13869、谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc 14067，以及由上述菌株制备的产生l-谷氨酸的突变体或菌株。
17、在本专利技术中，所述菌株的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的ph值等。其中，本文所述的“琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶”及其缩写名称“acta”是指能可以催化琥珀酰辅酶a和乙酸合成乙酰辅酶a的酶。如本文所使用，琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自棒状杆菌属——具体地，谷氨酸棒状杆菌——的微生物的琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶，但是不限于此。例如，琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶可以是seq id no:1的氨基酸序列或者与seq id no:1的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。
18、第二方面，本专利技术提供琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶突变体，所述突变体为氨基酸序列如seq id no：1所示，且372位的丝氨酸被其他氨基酸取代。
19、优选地，所述其他氨基酸为半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸。
20、所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶是指野生型acta蛋白，也即如seqid no：1所示氨基酸序列的多肽。
21、在一些实施方式中，所述的“突变”包含在seq id no：1所示序列的第372位丝氨酸被其他氨基酸取代，与seq id no：1所示序列的琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶相比，突变体能够提高谷氨酸的产量。
22、第三方面，本专利技术提供了编码所述琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶突变体的编码多核苷酸。
23、所述“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高的L-谷氨酸生产能力的菌株，其特征在于，所述菌株中琥珀酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶活性增强。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述琥珀酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶活性增强是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽的表达增强，或者含有氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽突变体，所述突变体是SEQ ID NO：1所示的多肽的372位丝氨酸被半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个取代。
3.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于，所述菌株是细菌，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，更具体如谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-谷氨酸的突变体或菌株。
4.如权利要求3所述的菌株，其特征在于，所述菌株是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869基础上改造获得的菌株，这些改造包
5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述谷氨酸生产菌株中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
6.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌进一步地经过改良，其中的NCgl1221同源基因中引入A111V突变，GltA编码基因中引入C361Y突变。
7.一种生物素蛋白连接酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示的琥珀酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶或其来源于谷氨酸棒状杆菌的同源酶的基础上，第372位的丝氨酸存在取代突变，且与SEQ ID NO：1所示序列的琥珀酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶相比，突变体能够提高谷氨酸的产量；所述同源酶的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1所示序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列；
8.如权利要求7所述琥珀酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶突变体的编码核酸。
9.如权利要求1至6任一项所述的菌株或如权利要求7-8所述琥珀酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶突变体或其编码多核苷酸在生产L-谷氨酸中的应用。
10.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括培养如权利要求1-6任一项所述的菌株使之生产L-谷氨酸，进一步包括从培养基中分离提取或回收L-谷氨酸的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种提高的l-谷氨酸生产能力的菌株，其特征在于，所述菌株中琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶活性增强。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述琥珀酰辅酶a乙酸辅酶a转移酶活性增强是氨基酸序列如seq id no：1所示的多肽的表达增强，或者含有氨基酸序列如seq id no：1所示的多肽突变体，所述突变体是seq id no：1所示的多肽的372位丝氨酸被半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个取代。
3.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于，所述菌株是细菌，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，更具体如谷氨酸棒杆菌atcc 13869、谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌b253、谷氨酸棒杆菌atcc 14067，以及由上述菌株制备的产生l-谷氨酸的突变体或菌株。
4.如权利要求3所述的菌株，其特征在于，所述菌株是在谷氨酸棒杆菌atcc 13032、谷氨酸棒杆菌atcc13869基础上改造获得的菌株，这些改造包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述谷氨酸生产菌株中还...
【专利技术属性】
技术研发人员：李广玉，郑平，蔡柠匀，周文娟，孙际宾，陈久洲，李德衡，赵兰坤，石拓，王小平，
申请(专利权)人：呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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