【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于表征端粒的至少一部分，如对其进行测序的方法以及用于此类方法中的衔接子。
技术介绍
1、难以表征端粒(即位于真核染色体端处的重复dna序列的区域)，如对其进行测序。这是由于多种原因，包括但不限于端粒是高度重复性和非线性的，自身循环形成置换环(d-环)以及端粒结合蛋白沿d-环结合。对端粒进行测序的方法是已知的，但这些方法通常涉及限制消化和/或pcr和southern印迹分析(lai,tp.,zhang,n.,noh,j.等人.《自然通讯(natcommun)》8,1356(2017)；bendix l,horn pb,jensen ub,rubelj i,kolvraa s.《老化细胞(aging cell)》.2010年6月；9(3):383-97；和bennett hw,liu n,hu y,king mc.《欧洲生化学会联合会快报(febs lett.)》2016年12月；590(23):4159-4170)。在这些方法中，端粒的序列必须从较短的序列重建，并且这些方法侧重于表征短端粒。使用pcr存在问题，因为聚合酶无法有效地复制如在端粒中发现的长段的重复序列。
2、生物孔(和其它纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接电生物传感器具有巨大的潜力。具体地，最近已经关注到作为潜在的dna测序技术的纳米孔。当跨纳米孔施加电势时，在分析物(如核苷酸)短暂驻留在桶中达某个时间段的情况下，电流发生变化。核苷酸的纳米孔检测给出了已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，使单个多核苷酸链通过孔并且衍生出核苷酸
3、纳米孔已用于通过用polya尾扩展端粒的3'突出端来表征端粒(sholes sl,karimian k,gershman a,kelly tj,timp w,greider cw.《基因组研究(genome res.)》2022年4月；32(4):616-628.doi:10.1101/gr.275868.121.)，但这种方法并不是专门针对端粒的，并且基因组dna中的许多其它3'突出端都被扩展。所述方法还使用聚合酶在另外的标记之前填充突出端。需要改进的表征端粒的方法。
技术实现思路
1、本专利技术人已经确定了一种用于表征端粒的至少一部分，如对其进行测序的具体方法。所述方法涉及将多核苷酸端粒衔接子与位于所述端粒的端处的非突出链的5'端连接。如下文更详细描述的，所述衔接子的3'端与所述突出链的第一部分特异性杂交，并且因此仅所述端粒的所述端将被适配。所述端粒衔接子然后可以用于表征所述端粒的所述至少一部分的在从所述端粒的所述端起的5'至3'方向上的经连接的非突出链。所述端粒衔接子不与所述染色体的任何其它部分连接，并且因此所述方法特异性地表征所述端粒的所述至少一部分。本质上，所述方法是一种用于特异性地表征所述端粒的所述至少一部分的富集策略。可以特异性表征所述端粒的一部分或整个所述端粒，并且所述方法还可以涉及表征以下中的一者或多者：所述亚端粒的一部分或整个所述亚端粒、所述染色质(即，基因组dna)的一部分或整个所述染色质、所述相对亚端粒的一部分或整个所述相对亚端粒以及所述相对端粒的一部分或整个所述相对端粒。所述方法可以与纳米孔测序组合使用，但并非必须如此。本专利技术的方法具有若干个优点，包括但不限于所述端粒的所述至少一部分的特异性和有效表征、序列以及长度的高分辨率、超越所述端粒并且进一步表征染色体的能力，包括表征整个染色体的可能性、不需要限制消化和片段大小控制、不需要pcr、鉴定所述端粒中的甲基化核苷酸或其它修饰的能力、鉴定存在或不存在端粒结合蛋白并且表征此类蛋白的能力。
2、在一优选实施例中，所述方法还包含在所述端粒的所述至少一部分的相对于所述端粒端的相对端处相对端处产生双链断裂，以及表征所述端粒的所述至少一部分的在相对方向上(即，朝向所述端粒的所述端)的未经连接的突出链。这允许表征所述端粒的所述至少一部分的两条链，并且提供增加的分辨率，尤其是在对重复端粒序列进行测序和鉴定修饰(如甲基化)方面。
3、本专利技术提供了一种用于表征端粒的至少一部分的方法，所述方法包含：
4、(a)将多核苷酸端粒衔接子与位于所述端粒的端处的非突出链的5'端连接，其中所述衔接子的3'端与突出链的第一部分特异性杂交，并且所述衔接子的5'端不与所述突出链的相对部分杂交；以及
5、(b)使用所述端粒衔接子表征所述端粒的所述至少一部分的在从所述端粒的所述端起的5'至3'方向上的经连接的非突出链。
6、本专利技术还提供了一种用于表征端粒的至少一部分的方法，所述方法包含(a)将多核苷酸端粒衔接子与位于所述端粒的端处的非突出链的5'端连接，其中所述的3'端与突出链的第一部分特异性杂交，并且所述衔接子的5'端不与所述突出链的相对部分杂交，(b)使用聚合物引导的效应蛋白在所述端粒的所述至少一部分的相对于所述端粒端的相对端处产生双链断裂并且将测序衔接子与所述相对端连接，以及(c)使用所述端粒衔接子表征所述端粒的至少一部分的在从所述端粒的所述端起的5'至3'方向上的经连接的非突出链，并且使用所述测序衔接子表征所述端粒的所述至少一部分的在朝向所述端粒的所述端的5'至3'方向上的未经连接的突出链。
7、本专利技术还提供了：
8、-一种多核苷酸端粒衔接子，其中所述衔接子的3'端与位于端粒的端处的突出链的第一部分特异性杂交，并且所述衔接子的5'端不与位于所述端粒的所述端处的所述突出链的相对部分杂交；
9、-一种六个端粒衔接子的群体，所述六个端粒衔接子中的每个端粒衔接子具有与位于端粒的端处的突出链的第一部分的六个可能序列之一特异性杂交的3'端和不与位于所述端粒的所述端处的所述突出链的相对部分杂交的5'端。
10、-一种用于表征端粒的至少一部分的试剂盒，所述试剂盒包含(a)一个或多个本专利技术的多核苷酸端粒衔接子或本专利技术的六个端粒衔接子的群体，以及(b)一个或多个夹板多核苷酸或一个或多个多核苷酸延伸部；以及
11、-一种系统，其包含(a)一个或多个本专利技术的多核苷酸端粒衔接子或本专利技术的六个端粒衔接子的群体，以及(b)纳米孔。
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1.一种用于表征端粒的至少一部分的方法，所述方法包含：
2.根据权利要求1所述的方法，其中表征所述端粒的所述至少一部分包含(a)对所述端粒的所述至少一部分进行测序，(b)测量所述端粒的所述至少一部分的长度，(c)对染色体或基因组进行端粒到端粒组装，(d)鉴定端粒或染色体融合，(e)鉴定所述端粒的所述至少一部分中的一种或多种修饰，(f)鉴定所述端粒的所述至少一部分作为变体，或(g)将所述端粒的所述至少一部分与特定细胞或组织类型连接。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法用于表征(i)整个所述端粒，(ii)整个所述端粒和亚端粒的至少一部分或整个所述亚端粒，(iii)整个所述端粒、整个所述亚端粒和染色质的至少一部分或整个所述染色质，(iv)整个所述端粒、整个所述亚端粒、整个所述染色质和相对亚端粒的至少一部分或整个所述相对亚端粒，或(v)整个所述端粒、整个所述亚端粒、整个所述染色质、整个所述相对亚端粒和相对端粒的至少一部分或整个所述相对端粒。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于表征两个或更多个不同染色体中的每个染色体上的
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包含使夹板多核苷酸与所述端粒衔接子的5'端杂交。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述夹板多核苷酸与测序衔接子相容。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包含将测序衔接子与所述端粒衔接子以及如果存在的话与所述夹板多核苷酸连接，并且步骤(b)包含使用所述测序衔接子表征所述端粒的所述至少一部分的在5'至3'方向上的所述经连接的非突出链。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包含将多核苷酸延伸部与所述端粒衔接子连接(ligate)或共价连接(attach)，或者步骤(a)使用端粒衔接子，所述端粒衔接子进一步包含在其5'端处的多核苷酸延伸部。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸延伸部包含测序衔接子，或者步骤(a)进一步包含将测序衔接子与所述多核苷酸延伸部共价连接，并且步骤(b)包含使用所述测序衔接子表征所述端粒的所述至少一部分的在从所述端粒的所述端起的5'至3'方向上的所述经连接的非突出链。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述多核苷酸延伸部使用点击化学与所述端粒衔接子共价连接或与所述测序衔接子共价连接。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述端粒衔接子包含生物素。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(a)进一步包含使用所述生物素富集所述端粒的所述至少一部分的所述经连接的非突出链。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述端粒衔接子的3'端的长度为至少5个或至少约7个核苷酸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述端粒衔接子的3'端与所述端粒衔接子的5'端之间存在一个或多个接头或间隔子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述接头是柔性接头或间隔子。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包含在步骤(a)之前使所述端粒与六个端粒衔接子的群体接触，所述六个端粒衔接子中的每个端粒衔接子具有与所述突出链的所述第一部分的六个可能序列之一特异性杂交的3'端和不与所述突出链的所述相对部分杂交的5'端。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经连接的非突出链使用纳米孔进行表征。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不包含(i)限制消化和/或(ii)扩增端粒的所述至少一部分或聚合酶链式反应(PCR)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含表征所述端粒的所述至少一部分的在朝向所述端粒的所述端的5'至3'方向上的未经连接的突出链。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法包含使用聚合物引导的效应蛋白在所述端粒的所述至少一部分的相对于所述端粒端的相对端处产生双链断裂并且将测序衔接子与所述相对端连接，以及使用所述测序衔接子表征所述端粒的所述至少一部分的在朝向所述端粒的所述端的5'至3'方向上的所述未经连接的突出链。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法在染色体的另一端处重复，并且所述方法包含表征整个染色体的两条链。
22.一种用于表征端粒的至少一部分的方法，所述方法包含(a)将多核苷酸端粒衔接子与位于所述端粒的端处的非突出链的5'端连接，其中所述的3'端与突出...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于表征端粒的至少一部分的方法，所述方法包含：
2.根据权利要求1所述的方法，其中表征所述端粒的所述至少一部分包含(a)对所述端粒的所述至少一部分进行测序，(b)测量所述端粒的所述至少一部分的长度，(c)对染色体或基因组进行端粒到端粒组装，(d)鉴定端粒或染色体融合，(e)鉴定所述端粒的所述至少一部分中的一种或多种修饰，(f)鉴定所述端粒的所述至少一部分作为变体，或(g)将所述端粒的所述至少一部分与特定细胞或组织类型连接。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法用于表征(i)整个所述端粒，(ii)整个所述端粒和亚端粒的至少一部分或整个所述亚端粒，(iii)整个所述端粒、整个所述亚端粒和染色质的至少一部分或整个所述染色质，(iv)整个所述端粒、整个所述亚端粒、整个所述染色质和相对亚端粒的至少一部分或整个所述相对亚端粒，或(v)整个所述端粒、整个所述亚端粒、整个所述染色质、整个所述相对亚端粒和相对端粒的至少一部分或整个所述相对端粒。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于表征两个或更多个不同染色体中的每个染色体上的一个或两个端粒的至少一部分。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包含使夹板多核苷酸与所述端粒衔接子的5'端杂交。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述夹板多核苷酸与测序衔接子相容。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包含将测序衔接子与所述端粒衔接子以及如果存在的话与所述夹板多核苷酸连接，并且步骤(b)包含使用所述测序衔接子表征所述端粒的所述至少一部分的在5'至3'方向上的所述经连接的非突出链。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包含将多核苷酸延伸部与所述端粒衔接子连接(ligate)或共价连接(attach)，或者步骤(a)使用端粒衔接子，所述端粒衔接子进一步包含在其5'端处的多核苷酸延伸部。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸延伸部包含测序衔接子，或者步骤(a)进一步包含将测序衔接子与所述多核苷酸延伸部共价连接，并且步骤(b)包含使用所述测序衔接子表征所述端粒的所述至少一部分的在从所述端粒的所述端起的5'至3'方向上的所述经连接的非突出链。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述多核苷酸延伸部使用点击化学与所述端粒衔接子共价连接或与所述测序衔接子共价连接。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述端粒衔接子包含生物素。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(a)进一步包含使用所述生物素富集所述端粒的所述至少一部分的所述经连接的非突出链。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述端粒衔接子的3'端的长度为至少5个或至少约7个核苷酸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述端粒衔接子的3'端与所述端粒衔接子的5'端之间存在一个或多个接头或间隔子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述接头是柔性接头或间隔子。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包含在步骤(a)之前使所述端粒与六个端粒衔接子的群体接触，所述六个端粒衔接子中的每个端粒衔接子具有与所述突出链的所述第一部分的六个可能序...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·G·福德姆，X·戴，S·希基，P·鲁加尼，C·泰尔，
申请(专利权)人：牛津纳米孔科技公开有限公司，
类型：发明
国别省市：
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