本发明专利技术涉及免疫技术领域，尤其涉及疫苗稀释液制备方法和应用。本发明专利技术提供了两种融合蛋白，他们组合的组合物能够具有良好的提高疫苗免疫效果的作用，有效延长疫苗免疫持续期，对动物体提供更高效的免疫保护力，同时疫苗稀释液生产工艺简单，成本低。
1、常用的疫苗分为“冻干苗”、“干粉苗”和“液体苗”三种。疫苗稀释液是指用于对疫苗进行稀释的溶剂或试剂。根据疫苗类型的不同，如冻干苗、干粉苗和液体苗，其所需的稀释液也各不相同。这些稀释液不仅可以帮助疫苗在体内更好地分散，还能为疫苗提供一定的保护和辅助作用。各疫苗生产厂家在对疫苗进行生产时，都有各自专用的稀释液，以保证疫苗的免疫效果。
7、尽管疫苗稀释液的研究已经取得了显著的进步，但当前稀释液仍存在一些缺点，例如：半衰期较短或对免疫效果的辅助作用较弱等。并且，针对不同种类的疫苗大多仍需要不同类型的稀释液，给临床使用带来了不便。
r/>技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供疫苗稀释液制备方法和应用。
2、本专利技术提供了两种融合蛋白，分别记作融合蛋白a和融合蛋白b。
3、本专利技术提供的融合蛋白a，由il-2蛋白、nps蛋白和wt1蛋白中的至少两者组成。
4、例如，本专利技术中所述融合蛋白a由il-2蛋白和nps蛋白组成，或者由il-2蛋白和wt1蛋白组成，或者由nps蛋白和wt1蛋白组成，或者由il-2蛋白、nps蛋白和wt1蛋白组成。
5、本专利技术对il-2蛋白、nps蛋白和wt1蛋白的来源不做限定，例如，本专利技术实施例中，其来自于鸡。
6、具体实施例中，所述il-2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；或者在如seq idno.1所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
7、具体实施例中，所述nps蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；或者在如seq idno.2所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
8、具体实施例中，所述wt1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；或者在如seq idno.3所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
9、本专利技术提供的融合蛋白a中，il-2蛋白、nps蛋白和wt1蛋白的连接顺序为：ril-2-nps-wt1、ril-2-wt1-nps、rnps-il-2-wt1、rnps-wt1-il-2、rwt1-il-2-nps或rwt1-nps-il-2。此外，本专利技术提供的融合蛋白a还可以为ril-2-nps、rnps-il-2、ril-2-wt1或rwt1-il-2。
10、本专利技术将 il-2与nps基因和wt1基因串联，获得的融合蛋白能够有助于机体更有效地清除病原体和/或肿瘤细胞，提高免疫防御能力。本专利技术中的融合蛋白a以来自于鸡的蛋白为例，注射到鸡体内后可以刺激il-2r受体高水平表达，促进il-2与il-2r结合后，通过激活多种信号通路，促进t细胞的增殖和分化，从而增强免疫应答。其次，il-2r受体表达水平的提高对于nk细胞的活化和功能也至关重要。il-2通过与nk细胞上的il-2r结合，激活nk细胞，促进其分泌γ干扰素等细胞因子，从而增强免疫应答，同时改造后的白介素-2蛋白生物学活性和稳定性更高而副作用更低，且其半衰期显著延长。
11、实验表明，将il-2蛋白、nps蛋白和wt1蛋白串联的效果优于将il-2与nps串联，或者将il-2与wt1串联的效果。而蛋白的串联顺序对免疫效果的提高也存在重要影响，实验表明，相对于其他串联顺序，il-2-nps-wt1的效果更优秀。
12、在融合蛋白a中，两个不同的蛋白之间通过linker连接，本专利技术对多种linker进行了尝试，例如：（g4s）n或（ag）n，结果表明，linker会影响融合蛋白a的生理活性和体内半衰期。其中，（g4s）n作为linker更能有效延长疫苗免疫持续期，作为优选，所述il-2蛋白与nps蛋白通过ggggsggggs连接，所述nps蛋白与wt1蛋白通过ggggsggggs连接。
13、本专利技术还提供了一种小肽，其氨基酸序列为rrryy（seq id no.13）。实验表明，该小肽插入蛋白中，特别是蛋白的n端，有利于进一步提高蛋白的生物学活性，特别是有利于进一步延长半衰期。
14、本专利技术提供了氨基酸序列为rrryy小肽在提高含有il-2片段的蛋白的生理活性中的应用。
15、本专利技术提供的融合蛋白a还包括氨基酸序列为rrryy的小肽。作为优选，所述融合蛋白a的n段包括氨基酸序列为rrryy的小肽。更优选的，所述il-2蛋白的n端还包括rrryy片段。
16、在一些具体实施例中，所述融合蛋白a的氨基酸序列如seq id no.4所示；或者在如seq id no.4所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。（记作il-2*-nps-wt1）。
17、进一步的，本专利技术还提供了融合蛋白b，其由caifn-γ蛋白和gata3蛋白组成。
18、本专利技术对caifn-γ蛋白和gata3蛋白的来源不做限定，例如，本专利技术实施例中，其来自于鸡。
19、具体实施例中，所述caifn-γ蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示；或者在如seq id no.5所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
20、所述gata3蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示；或者在如seq id no.6所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或具有与如前任一项所示的氨基酸序列同一性80%以上的序列。
21、本专利技术提供的融合蛋白b中，caifn-γ蛋白和gata3蛋白的连接顺序为：rcaifn-γ-gata3或r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.融合蛋白A，由顺序连接IL-2蛋白、NPS蛋白和WT1蛋白组成；
2.根据权利要求1所述的融合蛋白A，其特征在于，所述IL-2蛋白与NPS蛋白通过GGGGSGGGGS连接，所述NPS蛋白与WT1蛋白通过GGGGSGGGGS连接。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白A，其特征在于，所述IL-2蛋白的N端还包括RRRYY片段。
4.根据权利要求1~3任一项所述的融合蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
5.组合物，其包括权利要求1~4任一项所述的融合蛋白A和融合蛋白B；
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述CaIFN-γ蛋白与GATA3蛋白通过GGGGSGGGGS连接。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述融合蛋白B的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
8.根据权利要求5~7任一项所述的组合物，其特征在于，所述融合蛋白A和融合蛋白B的质量比为1:20000。
9.生物材料，其包括如下I）~IV）中至少一个：
10.根据权利要求9所述的生物材料，其特征在于，所述核酸中：
11.权利要求1~4任一项所述融合蛋白A、权利要求5~7任一项所述的组合物和/或权利要求9或10所述的生物材料在制备疫苗稀释液中的应用。
12.疫苗稀释液，其特征在于，包括：权利要求1~4任一项所述融合蛋白A和/或权利要求5~7任一项所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的疫苗稀释液，其特征在于，还包括：缓冲液、水相和油相，其中：
14.根据权利要求13所述的疫苗稀释液，其特征在于，
15.根据权利要求13所述的疫苗稀释液，其特征在于，其中，缓冲液、水相和油相的质量比为3:2:1。
16.根据权利要求12~15任一项所述的疫苗稀释液，其特征在于，其中融合蛋白A的浓度为1.34×10-4mg/L，融合蛋白B的浓度为2.67mg/L。
17.权利要求12~16任一项所述疫苗稀释液的制备方法，其包括：
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述乳化的条件包括：4000r/min高剪切乳化处理30min。
19.权利要求12~16任一项所述疫苗稀释液或权利要求17或18所述制备方法制得的疫苗稀释液，在稀释疫苗中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述疫苗为活疫苗、灭活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，
22.疫苗，其包括权利要求12~16任一项所述疫苗稀释液或权利要求17或18所述制备方法制得的疫苗稀释液。
...
【技术特征摘要】
1.融合蛋白a，由顺序连接il-2蛋白、nps蛋白和wt1蛋白组成；
2.根据权利要求1所述的融合蛋白a，其特征在于，所述il-2蛋白与nps蛋白通过ggggsggggs连接，所述nps蛋白与wt1蛋白通过ggggsggggs连接。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白a，其特征在于，所述il-2蛋白的n端还包括rrryy片段。
4.根据权利要求1~3任一项所述的融合蛋白a，其特征在于，其氨基酸序列如seq idno.4所示。
5.组合物，其包括权利要求1~4任一项所述的融合蛋白a和融合蛋白b；
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述caifn-γ蛋白与gata3蛋白通过ggggsggggs连接。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述融合蛋白b的氨基酸序列如seq idno.7所示。
8.根据权利要求5~7任一项所述的组合物，其特征在于，所述融合蛋白a和融合蛋白b的质量比为1:20000。
9.生物材料，其包括如下i）~iv）中至少一个：
10.根据权利要求9所述的生物材料，其特征在于，所述核酸中：
11.权利要求1~4任一项所述融合蛋白a、权利要求5~7任一项所述的组合物和/或权利要求9或10所述的生物材料在制备疫苗稀释液中的应用。
【专利技术属性】
技术研发人员：杜金玲，张志军，王文亚，李振义，白俊岩，孙林，杨玉娜，郭子煊，杨程宇，朱超月，张传林，
申请(专利权)人：北京宝易生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。