【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，特别涉及一种基于crispr与hcr联用技术的基因检测方法。
技术介绍
1、当前，单碱基突变检测方法的研究已经非常活跃，这些方法在癌症诊断、遗传疾病筛查和个体化治疗等领域具有重要意义。然而，现有方法存在着灵敏度低、操作复杂、对样品纯度要求高等问题，限制了它们在临床中的广泛应用。
2、crispr系统在核酸检测方面具有独特的优势。首先，可以通过设计sgrna实现对不同靶标序列的准确识别，具有灵活性和靶向性。其次，相较于数字pcr或测序方法，crispr系统的成本较低。此外，crispr系统能够在短时间内高效识别靶向序列，并且可以通过选择不同的cas效应蛋白发挥不同功能，具有较强的可设计性。然而，仅依靠crispr系统可能受到其本身的脱靶效应影响，从而降低检测精度。
3、因此，开发一种简便、高效且具有高灵敏度甚至可以实现单碱基差异区分的新型核酸检测方法具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供一种基于crispr与hcr联用技术的基因检测方法，该方法可以实现单碱基差异区分。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
3、本专利技术第一方面提供一种检测试剂，包括，
4、hcr序列，包括dna h1单体序列和dna h2单体序列；
5、crispr核糖核蛋白(ribonucleoprotein，rnp)复合
6、发夹识别探针，所述发夹识别探针为茎环发夹探针，所述发夹识别探针可与所述cas9切口酶切割所述靶标序列产生的单链结合并被打开，打开的发夹识别探针作为引发链，引发所述hcr序列发生hcr反应。
7、在本申请中cas9切口酶是指两个核酸酶结构域之一失活的cas9，这种酶只能切割靶dna的一条链。cas9切口酶是在ruvc样结构域或hnh样结构域中包含相对于野生型cas9序列或相对于其他cas9变体或cas9等同物中的等同氨基酸位置的一个或多个突变的cas9。比如cas9切口酶是在cas9的ruvc i催化结构域中包含相对于典型cas9序列或相对于其他cas9变体或cas9等同物中的等同氨基酸位置的天冬氨酸至丙氨酸取代(d10a)的cas9。或者cas9切口酶是包含相对于典型cas9序列或相对于其他cas9变体或cas9等同物中的等同氨基酸位置的h840a、n854a和/或n863a突变的cas9。
8、在一个或多个实施方式中，所述dna h1单体序列为：
9、ttttagagctagactacaactcagatccagagttgtagtctagct；
10、所述dna h2单体序列为：
11、gagttgtagtctagctctaaaaagctagactacaactctggatct；
12、所述sgrna序列为：
13、ucuagcucuaaaacguaguuggagcugguggguuuuagagcuagacuacaacu；
14、所述发夹识别探针序列为：
15、agttgtagtctagctctaaaacccaccagctccaactacgttttagagctaga；
16、agttgtagtctagctctaaaacccatcagctccaactacgttttagagctaga；或
17、agttgtagtctagctctaaaacccacaagctccaactacgttttagagctaga。
18、在一个或多个实施方式中，所述dna h1单体序列为：
19、ttttagagctagactacaactcagatccagagttgtagtctagct；
20、所述dnah2单体序列为：
21、gagttgtagtctagctctaaaaagctagactacaactctggatct；
22、所述sgrna序列为：
23、ucuagcucuaaaacguaguuggagcugguggguuuuagagcuagacuacaacu；
24、所述发夹识别探针序列为：
25、agttgtagtctagctctaaaacccaccagctccaactacgtttt agagc taga；
26、在一个或多个实施方式中，所述dna h1单体序列为：
27、ttttagagctagactacaactcagatccagagttgtagtctagct；
28、所述dnah2单体序列为：
29、gagttgtagtctagctctaaaaagctagactacaactctggatct；
30、所述sgrna序列为：
31、ucuagcucuaaaacguaguuggagcugguggguuuuagagcuagacuacaacu；
32、所述发夹识别探针序列为：
33、agttgtagtctagctctaaaacccatcagctccaactacgttttagagctaga。
34、在一个或多个实施方式中，所述dnah1单体序列为：
35、ttttagagctagactacaactcagatccagagttgtagtctagct；
36、所述dnah2单体序列为：
37、gagttgtagtctagctctaaaaagctagactacaactctggatct；
38、所述sgrna序列为：
39、ucuagcucuaaaacguaguuggagcugguggguuuuagagcuagacuacaacu；
40、所述发夹识别探针序列为：
41、agttgtagtctagctctaaaacccacaagctccaactacgttttagagctaga。
42、本专利技术第二方面提供一种荧光生物传感器，包括第一方面所提供的检测试剂和荧光染料。
43、在一个或多个实施方式中，所述荧光染料包括sybr greenⅰ荧光染料，evegreen、syto 9中的任意一种。
44、本专利技术第三方面提供一种基于crispr与hcr联用技术的基因检测方法，使用第一方面提供的检测试剂，包括：
45、将crispr rnp复合物与检测样品混合孵育形成crispr复合物；
46、在crispr复合物中加入发夹识别探针，得到crispr复合物和发夹识别探针的混合物，孵育；
47、加入hcr序列，进行hcr反应；
48、加入荧光染料，孵育；
49本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测试剂，包括，
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
4.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
5.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
6.一种荧光生物传感器，包括权利要求1-5中任一项所述的检测试剂和荧光染料。
7.根据权利要求6所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光染料包括SYBR GREENⅠ荧光染料，EveGreen、SYTO 9中的任意一种。
8.一种基于CRISPR与HCR联用技术的基因检测方法，使用权利要求1-5中任一项所述的检测试剂，包括：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述HCR反应在35-40℃条件下进行。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述HCR反应时间为2-4小时。
【技术特征摘要】
1.一种检测试剂，包括，
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
4.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
5.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
6.一种荧光生物传感器，包括权利要求1-5中任一项所述的检测试剂和荧光染料。
7.根据权利要求6所述的荧光生物传感器，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宏陆，张欢，袁恺余，罗中旭，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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