【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、细胞疗法采用经富集或修饰的人免疫细胞来靶向和杀死患者体内的癌细胞。为了增加免疫细胞靶向和杀死特定癌细胞的能力，已开发了工程化免疫细胞以表达将免疫细胞引导至特定靶癌细胞的构建体的方法。包括能够与特定肿瘤抗原相互作用的结合结构域的嵌合抗原受体(car)和工程化t细胞受体(tcr)允许免疫细胞靶向并杀死表达特定肿瘤抗原的癌细胞。
2、制备car或tcr细胞的主要挑战是将编码序列转移到靶免疫细胞。目前，绝大多数car t细胞生产依赖于病毒载体的转移。逆转录病毒基因与诱导型启动子结合可提高转导率，并产生相对大量的含car的t细胞。
3、基于载体的鼠白血病病毒(mlv)是最常用的γ逆转录病毒载体。然而，mlv的使用已与t细胞相关的白血病相关联。来自另一个逆转录病毒家族慢病毒的载体已示出更好的整合效率。慢病毒载体能够靶向非分裂细胞，这对于基于mlv的载体来说已是主要挑战。
4、病毒载体通常用于car t细胞生产，但重大挑战仍然存在。例如，病毒载体固有地与致癌和诱变潜力相关联。此外，在当前良好生产规范(cgmp)实验室中使用病毒受到严格的监管。同样重要的是，慢病毒/逆转录病毒转导受到病毒衣壳大小的限制，因此对转基因的大小设置了限制。此外，转基因的大小可能受到感兴趣基因和/或多基因表达对病毒载体本身生理学的影响的限制，包括由转基因引起的对病毒的潜在基因毒性。
5、然而，另一个重大挑战是高度复杂的自体细胞工程化和生产过程，通常需要至少一周，并且可能长达数周。在该过程期间，从患者身上收集
技术实现思路
1、在各种实施方案中，本公开提供了基于转座子的系统，用于将细胞治疗产品，诸如car和tcr引入到靶免疫细胞中。与常规的基于病毒载体的技术相比，该基于转座子的系统可携带更大的有效载荷，并可减少有效载荷中同源序列之间不期望的重组。在某些方面，基于转座子的系统将多基因编辑简化为一步转染。还提供了可在几天内或甚至在同一天内完成的缩短的自体过程。在某些方面，该缩短的自体过程可在4小时内完成。即使没有免疫细胞活化、富集或扩增，所得细胞群也比采用病毒载体的更长的自体过程获得更高的体内治疗功效。
2、这种缩短的过程可容易地引入到封闭的自动化设备中，并且在优选的位置处(例如，临床位点)而不是在集中的制造位点处进行。这对于常规的自体技术来说是不切实际的。可跳过常规技术所需的两种运输方式。同样重要的是，运输所需的冷冻/解冻步骤也可取消，这将进一步改善患者护理和产品质量两者。
3、根据本公开的一个实施方案，提供了一种包含编码多肽的转基因的转座子，该多肽包含第一嵌合抗原受体(car)和第二car，其中该第一car和该第二car各自包含单链片段(scfv)、跨膜结构域和基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。
4、在一些实施方案中，该转座子是选自由以下组成的组的dna转座子：睡美人转座子、piggybac转座子和tc buster转座子或反转录转座子，诸如r2转座子。在一些实施方案中，该转座子是睡美人转座子。
5、在一些实施方案中，该转基因的长度为至少5000个核苷酸。在一些实施方案中，该转基因的长度为至少6000、7000、8000、9000或10,000个核苷酸。在一些实施方案中，该转基因的长度大于10kb。
6、在一些实施方案中，该转基因中每个itam的编码序列经过密码子优化，使得彼此之间不具有12个连续核苷酸或更长的序列同一性。在一些实施方案中，该转基因中每个itam的编码序列经过密码子优化，使得彼此之间不具有9个连续核苷酸或更长的序列同一性。
7、在一些实施方案中，该itam是选自由以下组成的组的蛋白质的细胞质信号传导序列：tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。在一些实施方案中，itam是cd3ζ。
8、在另一个实施方案中，还提供了包含本公开的转座子的细胞。在一些实施方案中，该细胞是t细胞、nk细胞、nkt细胞、单核细胞、巨噬细胞、pbmc或它们的前体细胞(例如，ipsc)。
9、在一些实施方案中，该细胞还包含转座酶。在一些实施方案中，该转座酶选自由以下组成的组：转座酶、piggy-样转座酶、super (spb)转座酶、ppiggybat转座酶、睡美人转座酶、极度活跃的睡美人(sb100x)转座酶、helitron转座酶、tol2转座酶、tcbuster转座酶或极度活跃的tcbuster转座酶。在一些实施方案中，该转座酶是睡美人转座酶sb100x。
10、另一个实施方案提供了用于制备转染淋巴细胞的方法，该方法包括从供体受试者获得包含t细胞的样品；将该样品与转座子一起温育以转染该t细胞，从而产生转染的t细胞；以及在收获该t细胞之前，将包含该转染的t细胞的样品培养少于96小时，以产生收获样品，其中该收获样品中至少40％的t细胞是幼稚t细胞。在一些实施方案中，该收获样品中至少50％的t细胞是幼稚t细胞。
11、在一些实施方案中，该幼稚t细胞被表征为cd45ra+和ccr7+。在一些实施方案中，该幼稚t细胞进一步被表征为cd62l+、cd27+和cd28+。
12、在一些实施方案中，该t细胞在转染前未被活化。在一些实施方案中，该t细胞在转染前未被富集。
13、在一些实施方案中，该转基因的长度为至少5000个核苷酸。在一些实施方案中，该转基因的长度为至少6000个核苷酸。在一些实施方案中，该转基因的长度大于10kb。在一些实施方案中，该转座子包含编码嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的转基因。
14、在另一个实施方案中，提供了用于制备表达嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)的淋巴细胞的方法，该方法包括：从人类受试者采集包含淋巴细胞的生物样品；向淋巴细胞引入转座酶和转座子，该转座子包含编码包含car或tcr的多肽的转基因；以及收获包含该转座酶和该转座子的淋巴细胞，其中该淋巴细胞的收获发生在该生物样品采集后的96小时内。
15、在一些实施方案中，通过物理递送方法，诸如电穿孔、核转染、脂转染、超声或磁转染将该转座酶和该转座子引入该淋巴细胞。在一些实施方案中，通过电穿孔将该转座酶和该转座子引入该淋巴细胞。转座酶可作为dna、mrna或蛋白质递送到细胞中。
16、在一些实施方案中，该淋巴细胞的收获发生在该生物样品采集后的48小时内。在一些实施方案中，该方法还包括冷冻保存所收获的淋巴细胞，或将所收获的淋巴细胞注射给患者，其中该冷冻保存或该注射发生在该生物样品采集后的48小时内。
17、在一些实施方案中，该方法不包括淋巴细胞活化。在一些实施方案中，该方法不包括淋巴细胞富集。在一些实施方案中，该方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含编码多肽的转基因的转座子，所述多肽包含第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中第一CAR和所述第二CAR各自包含单链片段(scFv)、跨膜结构域和基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
2.根据权利要求1所述的转座子，其中所述转座子是选自由以下组成的组的DNA转座子：睡美人转座子、piggyBac转座子和Tc Buster转座子或反转录转座子。
3.根据权利要求2所述的转座子，其中所述转座子是睡美人转座子或Tc Buster转座子。
4.根据任一前述权利要求所述的转座子，其中所述转基因的长度为至少5000个核苷酸。
5.根据权利要求4所述的转座子，其中所述转基因的长度为至少6000个核苷酸。
6.根据任一前述权利要求所述的转座子，其中所述转基因中每个ITAM的编码序列经过密码子优化，使得彼此之间不具有12个连续核苷酸或更长的序列同一性。
7.根据权利要求6所述的转座子，其中所述转基因中每个ITAM的编码序列经过密码子优化，使得彼此之间不具有9个连续核苷酸或更长的序列同一性。
8
9.根据权利要求8所述的转座子，其中所述ITAM来源于CD3ζ、CD3ε或两者。
10.根据任一前述权利要求所述的转座子，其中所述第一CAR和所述第二CAR各自还包含细胞内共刺激结构域。
11.根据权利要求10所述的转座子，其中所述细胞内共刺激结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的信号传导区域：DAP-10、CD28、OX-40、4-1BB(CD137)、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、肿瘤坏死因子超家族成员14、TNFSF14、LIGHT)、NKG2C、Igα(CD79a)、Fcγ受体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、CDS、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD(CD11d)、ITGAE(CD103)、ITGAL(CD11a)、ITGAM(CD11b)、ITGAX(CD11c)、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE(RANKL)、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG(Cbp)、CD19a、特异性结合CD83的配体以及它们的组合。
12.根据权利要求2所述的转座子，其中所述细胞内共刺激结构域是DAP-10、4-1BB或CD28的信号传导区域。
13.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1至12中任一项所述的转座子。
14.根据权利要求13所述的细胞，所述细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞或它们的前体细胞。
15.根据权利要求13或14所述的细胞，所述细胞还包含异源转座酶。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述异源转座酶选自由以下组成的组：转座酶、样转座酶、Super (SPB)转座酶、piggyBac转座酶、睡美人转座酶、极度活跃的睡美人(SB100X)转座酶、Helitron转座酶、Tol2转座酶、TcBuster转座酶或极度活跃的TcBuster转座酶。
17.根据权利要求16所述的细胞，其中所述异源转座酶是睡美人转座酶SB100X或piggyBac转座酶...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种包含编码多肽的转基因的转座子，所述多肽包含第一嵌合抗原受体(car)和第二car，其中第一car和所述第二car各自包含单链片段(scfv)、跨膜结构域和基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。
2.根据权利要求1所述的转座子，其中所述转座子是选自由以下组成的组的dna转座子：睡美人转座子、piggybac转座子和tc buster转座子或反转录转座子。
3.根据权利要求2所述的转座子，其中所述转座子是睡美人转座子或tc buster转座子。
4.根据任一前述权利要求所述的转座子，其中所述转基因的长度为至少5000个核苷酸。
5.根据权利要求4所述的转座子，其中所述转基因的长度为至少6000个核苷酸。
6.根据任一前述权利要求所述的转座子，其中所述转基因中每个itam的编码序列经过密码子优化，使得彼此之间不具有12个连续核苷酸或更长的序列同一性。
7.根据权利要求6所述的转座子，其中所述转基因中每个itam的编码序列经过密码子优化，使得彼此之间不具有9个连续核苷酸或更长的序列同一性。
8.根据任一前述权利要求所述的转座子，其中所述itam是来源于选自由以下组成的组的蛋白质的细胞质信号传导序列：tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。
9.根据权利要求8所述的转座子，其中所述itam来源于cd3ζ、cd3ε或两者。
10.根据任一前述权利要求所述的转座子，其中所述第一car和所述第二car各自还包含细胞内共刺激结构域。
11.根据权利要求10所述的转座子，其中所述细胞内共刺激结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的信号传导区域：dap-10、cd28、ox-40、4-1bb(cd137)、cd2、cd7、cd27、cd30、cd40、程序性死亡-1(pd-1)、诱导型t细胞共刺激因子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1、cd11a/cd18)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd247、cd276(b7-h3)、肿瘤坏死因子超家族成员14、tnfsf14、light)、nkg2c、igα(cd79a)、fcγ受体、mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(slam蛋白)、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、cds、gitr、baffr、hvem(lightr)、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad(cd11d)、itgae(cd103)、itgal(cd11a)、itgam(cd11b)、itgax(cd11c)、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance(rankl)、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag(cbp)、cd19a、特异性结合cd83的配体以及它们的组合。
12.根据权利要求2所述的转座子，其中所述细胞内共刺激结构域是dap-10、4-1bb或cd28的信号传导区域。
13.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求1至12中任一项所述的转座子。
14.根据权利要求13所述的细胞，所述细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞、单核细胞、巨噬细胞或它们的前体细胞。
15.根据权利要求13或14所述的细胞，所述细胞还包含异源转座酶。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述异源转座酶选自由以下组成的组：转座酶、样转座酶、super (spb)转座酶、piggybac转座酶、睡美人转座酶、极度活跃的睡美人(sb100x)转座酶、helitron转座酶、tol2转座酶、tcbuster转座酶或极度活跃的tcbuster转座酶。
17.根据权利要求16所述的细胞，其中所述异源转座酶是睡美人转座酶sb100x或piggybac转座酶。
18.一种用于制备转...
【专利技术属性】
技术研发人员：Q·蔡，HC·蔡，K·蒋，
申请(专利权)人：凯德药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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