【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、工程化crispr/cas9系统是用于序列特异性基因编辑的强大工具(1-4)。然而，它也可能产生不希望的大缺失(5,6)、染色体易位(7)、染色体碎裂(8)和其他复杂的染色体重排以及脱靶效应。尽管已经开发出许多策略来最大限度减少crispr/cas9介导的脱靶效应(9)，但很少有方法可以减轻中靶附带的dna损伤。cas9切割靶dna以产生平末端或具有5’突出端的交错末端(10)。这些末端的修复通常通过典型的非同源末端连接(c-nhej)或微同源介导的末端连接(mmej)进行(11)。修复途径的选择决定了crispr/cas9编辑结果。mmej修复通常会导致缺失，尤其是大缺失(12,13)。cas9靶位点的系统分析表明，来自c-nhej途径的插入是精确且可预测的(14-16)。插入的频率和模式高度依赖于cas9切割位点周围的局部序列(17)。但可以增强这些结果的方法有限。因此，对基于cas酶的dna编辑的改善的安全性和精确度仍然存在着不断的需求。本公开与此需求相关。
技术实现思路
1、本公开提供了用于精确基因组编辑的组合物和方法。该组合物包括dna聚合酶，其代表性实例在下文进一步描述。在实施方案中，本公开提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：dna聚合酶片段，所述片段相对于参考dna聚合酶序列(即，野生型dna聚合酶序列)可以包含氨基酸序列变化，代表性氨基酸变化将在本文中进一步描述，和ms2噬菌体外壳蛋白的片段。单独的dna聚合酶或所述的融合蛋白用cas和一个或多个向
2、在实施方案中，使用非同源末端连接(nhej)产生插入/缺失，这至少部分地由所述dna聚合酶促进，所述dna聚合酶是本公开所涵盖的基因组编辑系统的组分。本公开提供了以无dna修复模板的方式产生插入/缺失。所述蛋白质在细胞核中作为crispr系统的组分发挥作用。因此，本文所述的任何蛋白质可以包括至少一个核定位信号。当使用所述融合蛋白时，其还可以包括一个或多个接头，所述接头例如将dna聚合酶与ms2分隔开，和/或将融合蛋白的片段与核定位信号分隔开。在实施方案中，融合蛋白包含自剪切肽序列，其可以例如在翻译过程中促进核糖体跳跃。因此，融合蛋白可以由编码在融合蛋白的n末端或c末端的额外氨基酸的mrna编码，通过自剪切肽序列的操作，这些氨基酸不会翻译为包含dna聚合酶和ms2蛋白片段的连续多肽的一部分。
3、在一个方面，本公开包括一种复合物，所述复合物包含cas酶、向导rna、蛋白质，所述向导rna任选地包含ms2噬菌体外壳蛋白结合位点，所述蛋白质包含dna聚合酶并且还任选地包含ms2结合蛋白。在非限制性实施方案中，当dna聚合酶与ms2蛋白组分一起使用时，向导rna包含ms2蛋白结合序列。还包括包含所述dna聚合酶或包含dna聚合酶和向导rna的融合蛋白的细胞。还提供了包含所述蛋白质的药物组合物。此类组合物还可以包含向导rna和cas酶。还包括包含所述蛋白质和复合物的细胞。本公开还提供编码所述蛋白质的表达载体和cdna，以及包含它们和/或其他组分的试剂盒。
4、在实施方案中，本公开提供了用于减少易位事件。例如，在cas9或其他位点特异性核酸酶(除所述casplus系统之外)靶向超过一个染色体位置的情况下，在一个或多个染色体上的超过一个位置的同时切割会产生已证明的易位事件的风险。本公开证明，通过使用所述casplus系统可以减少此类易位事件。因此，casplus系统可用于例如用不同靶向向导rna破坏一个或多个基因并在超过一个位置产生插入/缺失，同时相对于其他dna编辑酶减少易位的可能性。在实施方案中，与先前的方法相比，在任何真核细胞类型中实现了易位事件的减少，所述细胞包括但不限于淋巴细胞和白细胞，例如t细胞，所述t细胞包括但不一定限于表达嵌合抗原受体(car)的t细胞或可以使用任何其他向导引导的核酸酶进行修饰的其他类型的遗传修饰t细胞。
5、在另一个方面，本公开提供了一种在细胞中所选的染色体位点处产生插入/缺失的方法。该方法包括将所述蛋白质、cas酶和任选地包含ms2蛋白结合位点的向导rna引入细胞中，其中向导rna将cas酶、dna聚合酶和任选地ms2结合蛋白引导至所选的染色体位点，从而产生插入/缺失。在实施方案中，插入/缺失校正所选的染色体位点编码的开放阅读框中的突变或将序列转换为开放阅读框。在实施方案中，所选的染色体位点包括与单基因疾病相关的基因中的突变。在一个非限制性实施方案中，单基因疾病是肌营养不良症，其中所选的染色体位点包括包含突变的抗肌萎缩蛋白的基因。在这方面，杜氏肌营养不良症(dmd)是一种使人衰弱的神经肌肉疾病，会导致心脏和骨骼肌退化(18)，并且是由x连锁抗肌萎缩蛋白基因(dmd)的失活突变引起的(19)。扩张型心肌病(dcm)是dmd的常见致命特征(20)，其缺少治愈性治疗。我们之前曾使用crispr-cas9纠正在培养的人类细胞和mdx小鼠中的dmd突变(21-23)；然而，并未对经编辑的dmd位点处的不希望的dna损伤进行评估，这是人类疗法中的一个安全问题。因此，在实施方案中，与以前的方法相比，插入/缺失例如以较低的脱靶修饰频率校正编码突变的抗肌萎缩蛋白的基因。在某些实例中，插入/缺失包括一个或两个碱基对插入。在实施方案中，单基因疾病是囊性纤维化，其中所选的染色体位点包括包含与囊性纤维化相关的突变蛋白基因的基因。在一个实施方案中，所述系统校正编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(cftr)蛋白的基因中的f508del。
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1.一种DNA聚合酶蛋白，其任选地存在于包含MS2噬菌体外壳蛋白的片段的融合蛋白中，其中所述DNA聚合酶选自：
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶蛋白，其中所述DNA聚合酶是T4 DNA聚合酶并且包含D219A突变。
3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是RB69 DNA聚合酶蛋白并且包含D222A突变。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶蛋白存在于包含MS2噬菌体外壳蛋白的片段的融合蛋白中。
5.一种用于编辑DNA底物的系统，所述系统包含根据权利要求4所述的DNA聚合酶蛋白和Cas9核酸酶，所述Cas9核酸酶任选地包含选自位置F916、R919或Q920处的突变的突变，其中所述突变任选地选自F916P、F916del、R919P和Q920P及其组合。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述DNA聚合酶是T4 DNA聚合酶蛋白并且包含D219的突变，并且其中所述Cas9核酸酶包含选自F916P、F916del、R920P和Q920P的突变。
7.根据
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述DNA聚合酶蛋白包含MS2噬菌体外壳蛋白的片段。
9.根据权利要求5所述的系统，其中所述DNA聚合酶蛋白是包含D222的突变的RB69DNA聚合酶蛋白，并且其中所述Cas9核酸酶包含选自F916P、F916del、R920P和Q920P的突变。
10.根据权利要求9所述的系统，还包含至少一种向导RNA，所述向导RNA将所述系统引导至特定基因组位置并在不使用DNA修复模板的情况下产生插入/缺失，并且其中所述向导RNA任选地包含MS2噬菌体外壳蛋白结合位点。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述DNA聚合酶蛋白包含MS2噬菌体外壳蛋白的片段。
12.一种方法，包括将根据权利要求5所述的系统引入真核细胞，其中DNA聚合酶蛋白、Cas9核酸酶和所包含的向导RNA在DNA中由所述向导RNA的序列确定的位置处产生插入/缺失。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述DNA聚合酶是T4 DNA聚合酶蛋白并且包含D219的突变，并且其中所述Cas9核酸酶包含选自F916P、F916del、R920P和Q920P的突变。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述向导RNA任选地包含MS2噬菌体外壳蛋白结合位点。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述DNA聚合酶蛋白包含MS2噬菌体外壳蛋白的片段。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述DNA聚合酶蛋白是RB69 DNA聚合酶蛋白并且包含D222的突变，并且其中所述Cas9核酸酶包含选自F916P、F916del、R920P和Q920P的突变。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述向导RNA任选地包含MS2噬菌体外壳蛋白结合位点。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述DNA聚合酶蛋白包含MS2噬菌体外壳蛋白的片段。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述插入/缺失校正与肌营养不良症或囊性纤维化相关的基因中的突变。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述真核细胞是白细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中真核细胞白细胞是T细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述插入/缺失位于PDCD1、TRBC1、TRBC2或TRAC中的一个或多个中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述T细胞也被修饰，使得它们表达嵌合抗原受体。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种dna聚合酶蛋白，其任选地存在于包含ms2噬菌体外壳蛋白的片段的融合蛋白中，其中所述dna聚合酶选自：
2.根据权利要求1所述的dna聚合酶蛋白，其中所述dna聚合酶是t4 dna聚合酶并且包含d219a突变。
3.根据权利要求1所述的dna聚合酶，其中所述dna聚合酶是rb69 dna聚合酶蛋白并且包含d222a突变。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的dna聚合酶，其中所述dna聚合酶蛋白存在于包含ms2噬菌体外壳蛋白的片段的融合蛋白中。
5.一种用于编辑dna底物的系统，所述系统包含根据权利要求4所述的dna聚合酶蛋白和cas9核酸酶，所述cas9核酸酶任选地包含选自位置f916、r919或q920处的突变的突变，其中所述突变任选地选自f916p、f916del、r919p和q920p及其组合。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述dna聚合酶是t4 dna聚合酶蛋白并且包含d219的突变，并且其中所述cas9核酸酶包含选自f916p、f916del、r920p和q920p的突变。
7.根据权利要求6所述的系统，还包含至少一种向导rna，所述向导rna将所述系统引导至特定基因组位置并在不使用dna修复模板的情况下产生插入/缺失，并且其中所述向导rna任选地包含ms2噬菌体外壳蛋白结合位点。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述dna聚合酶蛋白包含ms2噬菌体外壳蛋白的片段。
9.根据权利要求5所述的系统，其中所述dna聚合酶蛋白是包含d222的突变的rb69dna聚合酶蛋白，并且其中所述cas9核酸酶包含选自f916p、f916del、r920p和q920p的突变。
10.根据权利要求9所述的系统，还包含至少一种向导rna，所述向导rna将所述系统引导至特定基因组位置并在不使用dna修复模板的情况下产生插入/缺失，并且其中所述向...
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