【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术提供了工程化t7 rna聚合酶变体及其组合物。这些变体已经被演化用于在体外转录起始时相对于gtp选择性掺入m7g(5’)ppp(5’)m7g帽类似物。本专利技术还提供了使用本文提供的变体的方法。本专利技术还提供了本文提供的组合物的用途。对序列表、表格或计算机程序的引用序列表的正式副本作为ascii格式化文本文件经由efs-web与说明书同时提交，文件名为“cx8-168cusp1_st25.txt”，创建日期为2017年7月5日，并且大小为184,320字节。经由efs-web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
技术介绍
0、专利技术背景
1、t7 rna聚合酶(e.c.2.7.7.6)，是一种单体噬菌体编码的dna指导的rna聚合酶，催化以5’至3’方向形成rna。在转录起始的过程中，t7 rna聚合酶识别特定的启动子序列(即，t7启动子)。天然存在的t7 rna聚合酶包含883个氨基酸。它与t3 rna聚合酶高度同源，并且与sp6 rna聚合酶在一定程度上同源。t7包含多个结构域，包括n末端结构域、“拇指”、“手掌”和“手指”(参见例如, sousa和mukherjee, prog. nucl. acid res. mol. biol., 73:1-41 [2003]，和美国专利第9,193,959号)。在功能酶的起始阶段和延伸阶段之间，n末端结构域的构象发生变化。
2、已经描述了编码t7 rna聚合酶的基因的克隆和表达(参见例如，美国专利第4,952,4
技术实现思路
0、专利技术概述
1、本专利技术提供了工程化t7 rna聚合酶变体及其组合物。这些变体已经被演化用于在体外转录起始时相对于gtp选择性掺入对称加帽的gtp类似物。本专利技术还提供了使用本文提供的变体的方法。本专利技术还提供了本文提供的组合物的用途。
2、本专利技术提供了工程化rna聚合酶，该工程化rna聚合酶包含与参考序列seq id no:4和/或seq id no:15或其功能片段具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的多肽序列，其中该工程化rna聚合酶在多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4或seq id no:15编号。
3、在一些实施方案中，工程化rna聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：32/357、49/642、97/357、136、137、160/643、167/514、250、302/513、314/401、357、392、393、394、397、401、404、444、446、478、513、514、582、635、636、637、639、642、643、645、653、656、660、660/806、661和664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化rna聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：32v/357i、49g/642l、97d/357g、136e/i、137w、160l/643s、167n/514l、250d、302v/513g、314c/401v、357g/k/l/m/n/q/r/s/t/v/w、392d、393l/y、394a/l/r、397f/m/q/w、401a/i/l/s/v、404e/y、444f/h/i/v、446w/y、478f/m/w、513c/f/k/l/r/t/w、514f/i/l/y、582n、635w、636l、637g/p/s、639h、642l、643a、645v、653c、656f/w、660a/c/m/s/t/w、660n/806y、661e/y和664w，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化rna聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：a32v/e357i、e49g/m642l、e97d/e357g、a136e/i、d137w、r160l/t643s、k167n/s514l、t250d、a302v/d513g、r314c/r401v、e357g/k/l/m/n/q/r/s/t/v/w、y392d、r393l/y、k394a/l/r、a397f/m/q/w、r401a/i/l/s/v、s404e/y、n444f/h/i/v、m446w/y、d478f/m/w、d513c/f/k/l/r/t/w、s514f/i/l/y、a582n、s635w、v636l、t637g/p/s、r639h、m642l、t643a、a645v、f653c、q656f/w、d660a/c/m/s/t/w、d660n/h806y、t661e/y和p664w，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no:4编号。
4、在一些实施方案中，工程化rna聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：397/513/635、397/513/635/660、513/660/664、513/635/660、513/635/664、513/660/664和660/664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no: 4编号。在一些另外的实施方案中，工程化rna聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：397f/513w/635w、397f/513y/635w、397w/513y/635w、397w/513w/635w、397w/513y/635w/660f、397w/513w/635w/660w、397y/513w/635w/660f、475v/513w/635w/660y、513f/660w/664y、513w/635w/660f、513w/635w/664w、513y/635w/660f、513y/635w/660y、513y/660w/664w和660y/664w，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no:4编号。在一些另外的实施方案中，工程化rna聚合酶包含至少一个选自以下的取代或取代集：a397f/d513w/s635w、a397f/d513y/s635w、a397w/d513y/s635w、a397w/d513w/s635w、a397w/d513y/s635w/d660f、a3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种工程化RNA聚合酶，所述工程化RNA聚合酶包含与参考序列SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:15或其功能片段具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的多肽序列，其中所述工程化RNA聚合酶在所述多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:15编号。
2. 如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述至少一个取代或取代集选自397/513/635、397/513/635/660、513/660/664、513/635/660、513/635/664、513/660/664和660/664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:4编号。
3. 如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述至少一个取代或取代集选自397、397/513、397/513/635、397/513/635/656、397/513/635/656/660、397/513/635/656/660/664、39
4. 如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述至少一个取代或取代集选自113/137/513、136/357/404/514、136/357/514、136/394/404/446、136/401、136/401/404、136/404/446、136/404/514、136/446、136/514、137、137/401、137/401/513、137/513、137/513/621、137/635、137/656、357/394/401/404/514、357/394/446/514、357/514、394/446/514、401/404、401/404/514、401/513/635、401/635、513/635、513/635/656、513/660、635/656、635/660和660，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考SEQ ID NO:15编号。
5.如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含与表5.3、表5.4、表5.5和/或表5.6中列出的至少一种工程化RNA聚合酶变体的序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的多肽序列。
6.如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含表5.3、表5.4、表5.5和/或表5.6中提供的工程化聚合酶变体。
7. 如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含与SEQ IDNO: 4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中列出的至少一种工程化RNA聚合酶变体的序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的多肽序列。
8. 如权利要求1所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶包含SEQ ID NO:4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39中列出的工程化聚合酶变体。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶与野生型T7 RNA聚合酶相比表现出至少一种改进的性质。
10.如权利要求9所述的工程化RNA聚合酶，其中所述至少一种改进的性质选自转录起始期间相对于GTP对帽类似物改进的选择性、改进的蛋白质表达、储存缓冲液中改进的稳定性和反应条件下改进的稳定性。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化RNA聚合酶保持与野生型T7 RNA聚合酶相当的RNA收率、转录保真性、热稳定性、蛋白质表达、在-20℃的稳定性或在反应条件下的稳定性。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化RNA聚合酶，其中所述工程化R...
【技术特征摘要】
1. 一种工程化rna聚合酶，所述工程化rna聚合酶包含与参考序列seq id no:4和/或seq id no:15或其功能片段具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的多肽序列，其中所述工程化rna聚合酶在所述多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4或seq id no:15编号。
2. 如权利要求1所述的工程化rna聚合酶，其中所述至少一个取代或取代集选自397/513/635、397/513/635/660、513/660/664、513/635/660、513/635/664、513/660/664和660/664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no:4编号。
3. 如权利要求1所述的工程化rna聚合酶，其中所述至少一个取代或取代集选自397、397/513、397/513/635、397/513/635/656、397/513/635/656/660、397/513/635/656/660/664、397/513/635/656/664、397/513/635/660、397/513/635/660/664、397/513/635/664、397/513/656/660、397/513/660、397/513/660/664、397/513/664、397/513、397/635、397/635/656/660/664、397/635/656/664、397/635/660、397/635/664、397/635/664/850、397/660、397/664，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no:4编号。
4. 如权利要求1所述的工程化rna聚合酶，其中所述至少一个取代或取代集选自113/137/513、136/357/404/514、136/357/514、136/394/404/446、136/401、136/401/404、136/404/446、136/404/514、136/446、136/514、137、137/401、137/401/513、137/513、137/513/621、137/635、137/656、357/394/401/404/514、357/394/446/514、357/514、394/446/514、401/404、401/404/514、401/513/635、401/635、513/635、513/635/656、513/660、635/656、635/660和660，和/或其任何组合，其中氨基酸位置参考seq id no:15编号。
5.如权利要求1所述的工程化rna聚合酶，其中所述工程化rna聚合酶包含与表5.3、表5.4、表5.5和/或表5.6中列出的至少一种工程化rna聚合酶变体的序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的多肽序列。
6.如权利要求1所述的工程化rna聚合酶，其中所述工程化rna聚合酶包含表5.3、表5.4、表5.5和/或表5.6中提供的工程化聚合酶变体。
7. 如权利要求1所述的工程化rna聚合酶，其中所述工程化rna聚合酶包含与seq idno: 4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和/或39中列出的至少一种工程化rna聚合酶变体的序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的多肽序列。
8. 如权利要求1所述的工程化rna聚合酶，其中所述工程化rna聚合酶包含seq id no:4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39中列出的工程化聚合酶变体。
9. 如权利要求1-8中任...
【专利技术属性】
技术研发人员：马修·G·米勒，庄静斌，奥斯卡·阿尔维左，美利莎·安·梅奥，詹姆斯·尼古拉斯·里金斯，易翔，乔纳森·S·彭菲尔德，吉伽特·W·哈思曼，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：
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