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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单细胞多组学测序,尤其涉及一种分析肿瘤细胞cin表观遗传特征的方法。
技术介绍
1、染色体不稳定性(cin)表现为细胞间染色体数目增加和缺失的频率增高,体现为细胞核型的异质性。众所周知,cin在癌症的发生和进化中发挥着关键作用,并且已经在各种癌症中被广泛记录。尽管cin与癌症之间存在着强烈的相关性,但它们之间的精确关系仍然是一个存在激烈争论的话题。
2、现有单细胞分析工具的局限性限制了对于核型异质性的研究和理解。例如,hela细胞系因其cin而备受关注,已经被广泛研究。之前的研究揭示,不同hela亚型、不同世代以及同一克隆之间都存在着显著的核型和染色体稳定性的异质性,尽管许多研究者已经记录了hela染色体的异质性,但并没有深入探讨其潜在的机制。值得注意的是,在hela-ccl2亚型中,个体细胞之间的染色体数目差异尤为明显。虽然这些差异已在多项研究中被观察到,但鲜有研究专注于鉴定和表征hela-ccl2细胞系内不同亚群以及探索它们差异的潜在机制。这是由于现有的单细胞分析工具的局限性,需要先进的单细胞多组学方法来弥补当前在核型异质性理解方面的关键缺陷。
3、最近,多组学测序技术的进步使得同时分析dna甲基化组、转录组和基因组成为可能。这些技术包括scm&t-seq(angermueller,c.et al.parallel single-cell sequencinglinks transcriptional and epigenetic heterogeneity.nat.method
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题,即现有的单细胞多组学技术无法进行核型分析,因而无法实现肿瘤细胞染色体不稳定性的表观遗传特征分析,本专利技术提供了一种分析肿瘤细胞cin(染色体不稳定性)表观遗传特征的方法。该方法能够同时测量单细胞的dna甲基化、基因表达和细胞核型,并在此基础上分析肿瘤细胞dna甲基化、基因表达和核型异质性之间的相关性,有助于更加深入地理解肿瘤发生和进化的机理。
2、本专利技术的具体技术方案为:
3、一种分析肿瘤细胞cin表观遗传特征的方法,包括:
4、1)从单个肿瘤细胞中提取rna和基因组dna;将rna制备成rna文库后测序;对基因组dna依次进行mspi酶切反应、亚硫酸盐转化、随机引物扩增和文库扩增,得dna文库后测序;
5、2)dna文库测序数据预处理后比对到基因组参考序列,鉴定出差异甲基化区域,并进行细胞核型分析,根据单细胞之间核型异质性将肿瘤细胞划分成不同亚组;
6、3)rna文库测序数据预处理后比对到基因组参考序列,定量基因表达水平;
7、4)根据2)和3)所得结果进行关联分析。
8、采用本专利技术的方法,能够同时测量单细胞的dna甲基化、基因表达和细胞核型,弥补了现有的单细胞多组学测序技术在核型分析上的空白,从而更加直观且可靠地区分同种肿瘤细胞(例如实施例中采用hela细胞进行了举例)之间的差异,可鉴定染色体核型异质性,并阐明这一现象与表观遗传(dna甲基化)和转录组(基因表达)因素之间的关系。因此,本专利技术的方法能够用于探索肿瘤细胞染色体不稳定性(cin)的表观遗传特征,有助于更加深入地理解肿瘤发生和进化的机理,并有望开发出针对肿瘤中cin的新型治疗策略。
9、单细胞不同组学方法的结合,可以在不同组学层面对细胞的生物学特征进行分析,研究各组学之间的关联性、协同性,在细胞亚群分类、细胞调节等研究中可以产生1+1>2的效果。而其难点就在于多个组学能共同覆盖的范围太少,影响了分析的全面性。每种单细胞单组学能覆盖的基因组范围、基因数目都极其有限,多个组学技术共同覆盖的就更稀缺了。
10、为了克服上述问题,本专利技术中设计了特殊的dna甲基化组建库方法,其具有较高的cpg覆盖率、基因组覆盖率和读深,能够有效捕获全基因组范围内的表观遗传学景观,在cgi、cgi shore、外显子、内含子、5'utr、3'utr、sine、line和ltr区域以及近端启动子、第一内含子、其他内含子和远端非编码区均展现出更高的覆盖度,且在调控区和非编码区以及在所有染色体上都展现出更加均匀的覆盖度。均匀覆盖和更高的读深有助于更精确地估计甲基化水平,提高染色体核型分型的可靠性和全面性,有利于在多组学层面分析肿瘤细胞cin表观遗传特征,更加准确地揭示细胞异质性。此外,在基因表达分析方面,本专利技术的方法也具有较高的基因覆盖率,有利于提高分析结果的准确性。
11、作为优选,步骤1)中,制备dna文库的具体过程包括:
12、1.1)向所得基因组dna中加入mspi酶切反应液进行酶切反应;
13、1.2)向1.1)所得产物中加入ct转换试剂,进行亚硫酸盐转化反应;
14、1.3)向1.2)所得产物中加入随机引物和dntp,进行随机引物扩增反应;
15、1.4)向1.3)所得产物中加入核酸外切酶i,进行酶切反应以消化引物,随后纯化产物;<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分析肿瘤细胞CIN表观遗传特征的方法,其特征在于,包括:
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中,制备DNA文库的具体过程包括:
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤1)中,从单个肿瘤细胞中提取RNA和基因组DNA的方法是将细胞裂解,并采用磁珠吸附基因组DNA,通过离心将吸附有基因组DNA的磁珠与含有RNA的上清液分离;在制备DNA文库的过程中,在进行MspI酶切反应之前,先进行基因组DNA重悬和蛋白酶消化。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)中,所述细胞核型分析的具体过程包括:
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2.1)中,采用PySAM的pileups方法获取比对到对应参考基因组位置的读取的碱基数。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)的具体过程包括:
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤4.1)中,采用MethGET程序分析不同亚组间DNA甲基化差异和基因表达差异之间的相关性。
8.根据权利要求1所述的方
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)中,所述基因表达水平包括读取计数和每千万比对读取的拷贝数。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中,按照MATQ协议,将所得RNA制备成RNA文库。
...【技术特征摘要】
1.一种分析肿瘤细胞cin表观遗传特征的方法,其特征在于,包括:
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中,制备dna文库的具体过程包括:
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤1)中,从单个肿瘤细胞中提取rna和基因组dna的方法是将细胞裂解,并采用磁珠吸附基因组dna,通过离心将吸附有基因组dna的磁珠与含有rna的上清液分离;在制备dna文库的过程中,在进行mspi酶切反应之前,先进行基因组dna重悬和蛋白酶消化。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)中,所述细胞核型分析的具体过程包括:
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于...
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