【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于生物催化，具体涉及一种硝基苯酚羟化酶突变体及其在制备二氢槲皮素中的应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、二氢槲皮素(taxifolin)，也称花旗松素，是从高寒带落叶松根部提取的生物类黄酮精华物质。二氢槲皮素拥有五个酚羟基的特殊分子结构，因此，它是迄今为止全球发现的最好的最稀缺的天然强效抗氧化剂，可有效去除人体内的自由基与毒素，因此二氢槲皮素具有消炎、抗菌、抗辐射、抗癌、抗病毒、调节免疫力、清除黑色素、改善微循环等广谱的生物活性和药理活性，是食品、药品、保健品生产的珍贵原料。
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3、当前二氢槲皮素的工业化生产仍然依赖于传统的植物提取，原料资源不足、提取难度大、产率较低等缺点阻碍了工业化应用的推进。目前酶法合成二氢槲皮素成为一种环境友好的研究方向，主要是以柚皮素为起始物料物料，2步得到二氢槲皮素，路线如scheme1和scheme 2所示。该路线合成过程中主要用到两个植物黄烷酮-3-羟化酶(f3h和f3’h)进行催化，得到二氢槲皮素，但这两个植物黄烷酮-3-羟化酶主要来源于植物，表达非常困难，尤其是f3’h的表达较难实现。
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5、为了寻找新的羟化酶来代替f3’h，经过前期的研究，我们从大肠杆菌中分离出一种硝基苯酚羟化酶(hpab)，该酶能催化柚皮素成为圣草酚，但不能催化其成为二氢山奈酚，同时也不能对二氢山奈酚产生作用，限制了hpab的有效利用和二氢槲皮素的高效合成。
6、因此，我们需要构建一种新的硝基苯酚羟化酶，实现单酶法催化合成二氢槲
技术实现思路
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技术实现思路
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1、二氢槲皮素在植物中以苷元或苷两种形式存在，分子结构中有2个手性碳(c2和c3)。黄酮类化合物，泛指由两个芳香环(a和b)通过中央三碳链(c)相互连接而形成的一系列化合物，其基本骨架为c6-c3-c6结构，如附图1所示。
2、通过对柚皮素和二氢山奈酚进行结构分析，发现两者仅在c环上多了一个羟基，其余结构完全相同，通过改造应该可以实现hpab催化二氢山奈酚。另外，hpab能催化b环上的位点羟基化，是否也可以催化c环上的羟基化，如果实现了两个环上不同位点的同时羟基化，则可以将催化工艺由双酶催化改为单酶法催化。
3、因此，针对现有硝基苯酚羟化酶的现有性质，本专利技术提供一种新的基苯酚羟化酶突变体并实现单酶催化合成二氢槲皮素。
4、一方面，本专利技术提供了一种新的硝基苯酚羟化酶突变体，该突变体是以seq idno.2所示的野生型硝基苯酚羟化酶为模板，通过位点突变获得。
5、进一步，所述野生型硝基苯酚羟化酶来源于大肠杆菌(escherichia coli w)，ncbi登录号为cad6019151.1，核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
6、更进一步，所述野生型硝基苯酚羟化酶只能催化柚皮素成为圣草酚，但不能将柚皮素催化成为二氢山奈酚，同时也不能将二氢山奈酚催化成为二氢槲皮素。
7、进一步，将底物柚皮素和二氢山奈酚分别与hpab的晶体结构6qyi进行分子对接(晶体结构见附图2)，发现谷氨酰胺q212和天冬氨酸d466形成底物封口，严重影响二氢山奈酚的进入，形成了较大的空间位阻。
8、更进一步，为了方便二氢山奈酚的进入，将野生型硝基苯酚羟化酶的q212突变为丙氨酸，d466突变为甘氨酸，获得硝基苯酚羟化酶突变体mut1(q212a/d466g)，该突变体能够将二氢山奈酚转化为二氢槲皮素。
9、更进一步，所述硝基苯酚羟化酶突变体mut1的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
10、进一步，为了使得硝基苯酚羟化酶也能够将圣草酚转化为二氢槲皮素，在硝基苯酚羟化酶突变体mut1的基础之上继续进行改造。
11、更进一步，在硝基苯酚羟化酶突变体mut1的催化活性中心附近选择结合位点g112，r113，y117，t196，n197，y301，a305进行饱和突变。通过饱和引物设计和高通量的筛选，最终获得了对圣草酚和二氢山奈酚都有催化活力的硝基苯酚羟化酶突变体mut2(r113a/y117s/q212a/a305g/d466g)。
12、更进一步，所述硝基苯酚羟化酶突变体mut2的核苷酸序列和氨基酸序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。
13、更进一步，所述硝基苯酚羟化酶突变体mut2既保留了原有的催化柚皮素为圣草酚的能力，又具有了催化圣草酚为二氢槲皮素的能力。
14、更进一步，实现了柚皮素在硝基苯酚羟化酶突变体mut2作用下单酶法制备二氢槲皮素。
15、本专利技术的有益效果在于，本专利技术通过饱和引物设计和高通量的筛选，获得了对二氢山奈酚具有催化活力硝基苯酚羟化酶突变体mut1，以及对圣草酚和二氢山奈酚都具有催化活力的硝基苯酚羟化酶突变体mut2。经过细胞表达后，突变体mut2在体外对柚皮素进行催化，直接得到二氢槲皮素，合成浓度达到280mg/l，实现了利用单酶法体外合成二氢槲皮素，为二氢槲皮素的酶法催化提供高效合成途径。
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1.一种硝基苯酚羟化酶突变体，其特征在于，所述硝基苯酚羟化酶突变体Mut1和Mut2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示。
2.如权利要求1所示的硝基苯酚羟化酶突变体，其特征在于，所述硝基苯酚羟化酶突变体Mut1和Mut2的核苷酸基因序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示。
3.如权利要求1所示的硝基苯酚羟化酶突变体，其特征在于，所述硝基苯酚羟化酶突变体表达于基因工程菌。
4.如权利要求1所示的硝基苯酚羟化酶突变体，其特征在于，所述硝基苯酚羟化酶突变体Mut1可以将二氢山奈酚转化为二氢槲皮素。
5.如权利要求1所示的硝基苯酚羟化酶突变体，其特征在于，所述硝基苯酚羟化酶突变体Mut2可以将柚皮素单酶转化为二氢槲皮素。
【技术特征摘要】
1.一种硝基苯酚羟化酶突变体，其特征在于，所述硝基苯酚羟化酶突变体mut1和mut2的氨基酸序列分别如seq id no:4和seq id no:6所示。
2.如权利要求1所示的硝基苯酚羟化酶突变体，其特征在于，所述硝基苯酚羟化酶突变体mut1和mut2的核苷酸基因序列分别如seq id no:3和seq id no:5所示。
3.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：张小飞，尹丹萍，竺伟，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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