【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及荧光免疫层析检测，具体涉及一种检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条、制备方法及检测方法。
技术介绍
1、黄曲霉毒素(aflatoxin，af)是黄曲霉(aspergillus flavus)和寄生曲霉(aspergillu sparasiticus)的次级代谢产物，其种类繁多，目前已分离鉴定出12种以上，常见的有黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1、m2、b2a、g2a、bm2a和gm2a等，其中以黄曲霉毒素b1(aflatoxin b1，afb1)分布最广、毒性最强、危害最大。af的热稳定性非常好，280℃才可裂解，故常规加工温度下难以破坏其分子结构和致毒性。afb1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，其分子结构中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，在已知的化学物质中致癌力居首位，其急性毒性是氰化钾的10倍，其慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍。afb1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害，人的原发性肝癌也很可能与之有关。afb1在天然食物和药物中，特别是在干燥保存材料中的检出率较高，国家质检总局规定afb1是大部分食品的必检项目之一，《中国药典》也规定afb1是动物类、辛香类等多种中药饮片的必检项目之一。
2、目前，检测afb1的方法有很多，常用的有薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、酶联免疫法(elisa)、液质联用法(hplc-ms)等，这些方法的检测时间大都比较长，且需要特定的检测设备，操作不便，检测成本高，应用范围较为局限。免
3、免疫层析技术通过酶反应或直接利用可目测的标记物所显示的直观实验现象而获得测定结果，其中的标记物有胶体金、乳胶、胶体硒、明胶等，而最常用的是胶体金。但是胶体金免疫层析技术受背景干扰大，易出现假阳性；其中胶体金与目标蛋白以静电吸附作用结合在一起，稳定性差，容易出现假阴性；胶体金免疫层析技术检测灵敏度较低，在实际检测中只能用于定性或半定量检测。
4、在免疫层析检测技术中，除了采用胶体金作为标记物外，己有相关专利报道了以荧光纳米微粒为标记物进行免疫层析检测，如公开号为cn1645146a的专利技术专利申请公开了一种用荧光稀土纳米颗粒作为标记物的免疫层析方法及其检测试纸条的制备，该方法能提高免疫层析检测的灵敏度，但该方法并未解决化学小分子抗原性弱的问题；公开号为cn116656688a和cn116590384a的专利技术专利申请分别公开了特异性识别afb1的适配体及其优化方法，该方法避开了afb1抗原性问题，基于dna链反应进行标记，但是afb1与单链dna结合的影响因素较多，检测结果缺乏稳定性，其应用范围受到限制。
5、本专利技术旨在提出一种检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条、制备方法及检测方法，以期为中药饮片等样品中黄曲霉毒素b1的定量检测提供新的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于，克服现有技术中存在的缺陷，提供一种检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条、制备方法及检测方法，本专利技术的检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条，结构设计简单，制备实施可行性高，造价成本低，使用操作方便、快速，易于推广普及，实用性好；荧光微球标记的黄曲霉毒素b1抗体a为核壳结构纳米粒子，荧光微球作为核壳结构纳米粒子的内核，不易受外界环境因素(例如溶液干扰)的影响，并且有助于增加荧光微球上荧光物质所发射荧光强度的稳定性和荧光寿命，从而扩大了本专利技术荧光微球免疫层析试纸条可检测适用的样品范围，相对于胶体金免疫层析技术，显著提高了检测结果的精准度和可靠性，并且检测灵敏度也大幅提高。本专利技术的一种使用荧光微球免疫层析试纸条定量检测样品中黄曲霉毒素b1的方法，操作简单，预先将一系列浓度的黄曲霉毒素b1标准品溶液对应的黄曲霉毒素b1荧光强度-浓度标准曲线保存在荧光分析仪的分析软件中，从而样品供试溶液中黄曲霉毒素b1的浓度由荧光分析仪的分析软件计算得到，显著降低了人工计算劳动量，并且有助于消除人为误差因素，确保转换得到的待测样品中黄曲霉毒素b1含量结果数据可靠性高、精准性好和稳定性好。
2、本专利技术目的之一，设计一种检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条，包括底板，所述的底板上侧面依次搭接地设置有滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；
3、所述的玻璃纤维膜上附着有荧光微球标记的黄曲霉毒素b1抗体a，荧光微球标记的黄曲霉毒素b1抗体a为核壳结构纳米粒子，其中荧光微球作为核壳结构纳米粒子的内核，黄曲霉毒素b1抗体a偶联附着于荧光微球的外侧面作为核壳结构纳米粒子的外壳；
4、所述的硝酸纤维素膜上设置有包被黄曲霉毒素b1抗体b的检测线和包被有二抗或黄曲霉毒素b1合成抗原的质控线。
5、优选的技术方案是，所述的荧光微球由nahco3、k2s2o8、荧光物质、苯乙烯于溶剂中反应制得，其粒径范围为50～300nm；
6、所述的黄曲霉毒素b1抗体a于含有硼酸-四硼酸钠-吗啉乙磺酸的缓冲液体系中通过偶联反应附着于荧光微球的外侧面，并经大分子蛋白封闭。
7、进一步优选的技术方案还有，所述的荧光物质为罗丹明b甲酯、异硫氰酸罗丹明、异硫氰酸荧光素、荧光烷衍生物、6-梭基荧光素酞胺酷、香豆素类有机荧光染料或其掺杂物以及量子点中的一种或几种，所述的大分子蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
8、进一步优选的技术方案还有，所述的底板为pvc板，所述的样本垫为聚酯膜或玻璃纤维膜。
9、本专利技术目的之二，设计一种上述检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括如下操作步骤：
10、s1：称取一定质量的nahco3和k2s2o8溶于去离子水中，形成无机盐水溶液；称取一定质量的荧光物质溶于无水乙醇和苯乙烯的混合液中，形成含有荧光物质的溶液；将含有荧光物质的溶液加入制备好的无机盐水溶液中，摇匀并向混合溶液体系中通入一定时间的氮气，然后置于一定温度的恒温水浴锅中震摇反应一定时间，取出并将离心分离得到的沉淀物用无水乙醇、去离子水洗涤数次，得荧光微球；
11、s2：称取适量步骤s1制备的荧光微球，并与一定量的硼酸-四硼酸钠缓冲液涡旋混匀，加入一定量的吗啉乙磺酸缓冲液混合均匀，室温震荡一段时间后离心分离丢弃上清液，沉淀加入一定量的硼酸-四硼酸钠缓冲液重悬，加入一定量的黄曲霉毒素b1抗体a，混合均匀，于室温环境下偶联反应一段时间，然后加入一定量的大分子蛋白封闭反应一段时间，离心分离丢弃上清液，沉淀中加入一定量的胶乳，混合均匀，得荧光微球标记的黄曲霉毒素b1抗体a胶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述的底板上侧面依次搭接地设置有滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；
2.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述的荧光微球由NaHCO3、K2S2O8、荧光物质、苯乙烯于溶剂中反应制得，其粒径范围为50～300nm；
3.如权利要求2所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述的荧光物质为罗丹明B甲酯、异硫氰酸罗丹明、异硫氰酸荧光素、荧光烷衍生物、6-梭基荧光素酞胺酷、香豆素类有机荧光染料或其掺杂物以及量子点中的一种或几种，所述的大分子蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
4.如权利要求3所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述的底板为PVC板，所述的样本垫为聚酯膜或玻璃纤维膜。
5.如权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
6.如权利要求5所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条的制备
7.如权利要求6所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述的步骤S2中，硼酸-四硼酸钠缓冲液的pH＝8.0，吗啉乙磺酸缓冲液的pH＝6.0。
8.一种使用荧光微球免疫层析试纸条定量检测样品中黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所用的荧光微球免疫层析试纸条为上述权利要求1～4中任意一项所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光微球免疫层析试纸条，包括如下操作步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述的底板上侧面依次搭接地设置有滤纸、样本垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；
2.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述的荧光微球由nahco3、k2s2o8、荧光物质、苯乙烯于溶剂中反应制得，其粒径范围为50～300nm；
3.如权利要求2所述的检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述的荧光物质为罗丹明b甲酯、异硫氰酸罗丹明、异硫氰酸荧光素、荧光烷衍生物、6-梭基荧光素酞胺酷、香豆素类有机荧光染料或其掺杂物以及量子点中的一种或几种，所述的大分子蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
4.如权利要求3所述的检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述的底板为pvc板，所述的样本垫为聚酯膜或玻璃纤维膜。
5.如权利要求4所述的检测黄曲霉毒素b1的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
6.如权利要求5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王尽想，刘薇，夏国华，张高晨，
申请(专利权)人：江苏三联星海医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：
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