【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种利用全细胞转化生物质水解液合成d-阿洛酮糖的方法。
技术介绍
1、木质纤维素是一种廉价、清洁、可再生的生物资源，是自然界中含量最丰富的碳水化合物，地球上每年光合作用可产生高达150亿～200亿吨的植物干物质，其中50%以上是木质纤维素类生物质。其中玉米芯由纤维素(32%～36%)、半纤维素(35%～40%)、木质素(13.1%)以及少量灰分、果胶和含氮化合物等组成。纤维素是由d-葡萄糖以β-1,4糖苷键组成的大分子多糖，每个纤维素分子大约由500～10000个葡萄糖分子组成，可经预处理、纤维素酶水解等过程获得富含葡萄糖的生物质水解液，可应用于生物燃料、营养功能化学品等高值化学品的生产。
2、功能性单糖d-阿洛酮糖(d-allulose)是一种己酮糖，是d-果糖的c-3差向异构体，同时也是代表性的低热量稀有糖，热量值只有蔗糖的10％，2014年，美国食品药品监督管理局批准d-阿洛酮糖为蔗糖的安全替代品。d-阿洛酮糖具有许多生理功能，例如抗高血压、降高脂血症、抗氧化剂和抗动脉粥样硬化作用。此外，d-阿洛酮糖可用作药物和其他稀有糖的前体。
3、目前，d-阿洛酮糖主要合成方法有化学合成法和生物合成法，其中化学合成法主要有三种，分别是：（1）以葡萄糖为原料，钼酸盐作为催化剂，在80～120℃条件下保温反应2～5h即可催化生成d-阿洛酮糖产品；（2）以d-果糖为原料，通过糖类化合物中羟基的异丙叉基和苄醚的保护与脱保护等过程，设计合成出β-d-吡喃阿洛酮糖衍生物，再通过氧化、还原的方法得
4、与化学合成法相比，生物合成法具有更大的优势：副产物少、立体选择性高、反应条件温和，更适合工业化生产。但仍具有成本较高，产物得率较低等问题。生物质来源广泛且具有可再生的特点，以生物质为底物可大大降低生产成本，但生物质底物存在水解效率低、杂质多、抑制酶活性等问题，如何最大价值利用生物质原料来生产高值化学品仍然是一个巨大的挑战。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种利用全细胞转化生物质水解液合成d-阿洛酮糖的方法，利用该方法可以实现从生物质水解液一步法转化为d-阿洛酮糖溶液。
2、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
3、一种利用全细胞转化生物质水解液合成d-阿洛酮糖的方法，所述方法为：
4、以重组大肠杆菌经诱导培养后的培养液获得的湿菌体为催化剂，在金属离子的存在下，以生物质水解液为底物，进行催化反应制得d-阿洛酮糖；
5、所述重组大肠杆菌为同时表达葡萄糖异构酶和d-阿洛酮糖-3差向异构酶的重组大肠杆菌；
6、进一步，所述重组大肠杆菌为含有葡萄糖异构酶的编码基因gi和d-阿洛酮糖-3差向异构酶的编码基因dae的重组大肠杆菌。
7、所述葡萄糖异构酶的编码基因gi来源于嗜热厌氧杆菌 thermoanaerobacter thermocopriae，核苷酸序列如seq id no 1所示或seq id no 1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸残基且仍能够表达具有葡萄糖异构酶活性的酶的核苷酸序列；d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因dae来源于鸡尾草菌 caballeronia concitans，核苷酸序列如seq id no 2所示或seq id no 2所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸残基且仍能够表达具有d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的酶的核苷酸序列。
8、进一步，所述重组大肠杆菌含有重组质粒，所述重组质粒含有葡萄糖异构酶的编码基因gi和d-阿洛酮糖-3差向异构酶的编码基因dae。
9、进一步，所述重组大肠杆菌是将重组质粒转化入大肠杆菌得到。所述大肠杆菌优选大肠杆菌bl21(de3)。
10、所述重组质粒一般按以下方法构建得到：
11、将来源于嗜热厌氧杆菌（ thermoanaerobacter thermocopriae）的葡萄糖异构酶的编码基因gi和来源于鸡尾草菌 caballeronia concitans的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因dae（ncbi序列号为wp_040049840.1），连接到质粒载体上，得到重组质粒，gi基因和dae基因的核苷酸序列分别如seq id no 1和seq id no 2所示：
12、gi 基因，seq id no 1：
13、atggaatacttcaagaacgttccgcagattaaatatgaagggccgaaaagcaacaacccgtacgccttcaaattctataatccggacgaaattatcgacggcaaaccgctgaaagagcacctgcgtttcagcgtggcatattggcatacatttaccgcaaatggcaccgacccattcggtgcaccgaccatgcagcgtccttggaatcatctgagcgatccgatggatatagcaaaagcccgtgttgaagcagcattcgaattcttcgagaaactggacgtgccgtttttttgttttcatgatcgcgacatagcacctgaaggcgaaaatctgcgtgaaacgaataagaatctggataccatagtggcaatgattaaagattatctgaagacctcaaagaccaaggtgctgtggggtaccgcaaatctgtttagcaatccgcgtttcgttcatggtgcagcaacctcatgtaatgcagacgtgtttgcgtatgcagcagcccaagttaaaaaagcactggaaattaccaaagaactgggcggccaaaattatgttttttggggcggtcgtgaaggttatgaaaccctgctgaataccgatatggaactggaactggataatctggcaagatttttacatatggcagttgaata本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用全细胞转化生物质水解液合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于所述方法：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌为含有葡萄糖异构酶的编码基因GI、D-阿洛酮糖-3差向异构酶的编码基因DAE的重组大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述葡萄糖异构酶的编码基因GI来源于嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacter thermocopriae，核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因DAE来源于鸡尾草菌Caballeronia concitans，核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌是将重组质粒转化入大肠杆菌得到；所述重组质粒含有葡萄糖异构酶的编码基因GI和D-阿洛酮糖-3差向异构酶的编码基因DAE。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述重组质粒按以下方法构建得到：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述质粒载体为pETDue
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述重组质粒为pACYCDuet-GI-DAE，按以下方法构建得到：
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应中，反应体系的pH为6.0-8.0；反应温度为65-100℃，反应时间为2-6 h；金属离子为Co2+，Co2+浓度为0.1-3.5 mM。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述反应中，反应体系的pH值为6.0，反应温度为75℃，Co2+浓度为2 mM。
...【技术特征摘要】
1.一种利用全细胞转化生物质水解液合成d-阿洛酮糖的方法，其特征在于所述方法：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌为含有葡萄糖异构酶的编码基因gi、d-阿洛酮糖-3差向异构酶的编码基因dae的重组大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述葡萄糖异构酶的编码基因gi来源于嗜热厌氧杆菌thermoanaerobacter thermocopriae，核苷酸序列如seq id no 1所示。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的编码基因dae来源于鸡尾草菌caballeronia concitans，核苷酸序列如seq id no 2所示。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述重组大肠杆菌是将重组质粒转化入大肠杆菌得到；所述重组质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡雪，柳志强，郑裕国，方欣悦，孙晨阳，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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