【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体中的特异性卵黄抗体的制备和应用，具体涉及一种聚对苯二甲酸乙二醇酯人工抗原的制备方法，以及抗pet禽源多克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
1、纳米塑料（mnps）是指直径小于100 nm的微塑料，它们在环境中的潜在积累及其对人类健康的影响是当前科学研究的焦点。纳米塑料可能通过食物链、饮用水、空气等途径进入人体。研究表明，微塑料和纳米塑料的暴露可能会加剧炎症并影响远端器官，增加非传染性疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病和慢性肺病的风险。聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）是一种热塑性聚酯，具有优良的物理机械性能和电绝缘性。因此pet被广泛应用于食品包装行业以及日常生活用品中，且被人类无节制的使用，从而造成pet在人体内的累积。进而对人体产生不利影响，包括潜在的炎症反应、内分泌干扰和细胞损伤等，造成包括神经退行性疾病、生殖问题、心脏病、癌症和自身免疫性疾病等。鉴于pet对生命系统和人类健康的重要影响，开发能够识别pet的检测技术具有重要意义，面对pet的挑战，抗体开发变得尤为迫切。传统的抗体制备方法（如小鼠或兔抗体制备）可能难以获得针对pet的特异性抗体。卵黄抗体（igy）因其制备过程相对简单、产量高、无哺乳动物病原体污染及较低的交叉反应性，逐渐成为生物医学研究中一种重要的工具。因此，针对pet开发一种高效的制备卵黄抗体的方法，对于进一步详细评估纳米塑料对人体健康的长期影响研究具有重要意义。
2、本专利提供了一种聚对苯二甲酸乙二醇酯pet人工抗原的制备方法、抗pet禽源多克隆抗体的制备方法、用于检测聚对苯二甲
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的在于提供一种聚对苯二甲酸乙二醇酯pet人工抗原的制备方法；
2、本专利技术的第二个目的在于提供一种抗pet禽源多克隆抗体的制备方法；
3、本专利技术的第三个目的是建立一种用于检测聚对苯二甲酸乙二醇酯的免疫检测方法；
4、本专利技术的第四个目的是提供一种用于检测聚对苯二甲酸乙二醇酯pet含量的ic-elisa检测试剂盒。
5、具体地，本专利技术的第一个目的是提供一种pet人工抗原的制备方法，所述方法包括如下步骤：
6、（1）将10 mg bsa蛋白溶于200 μl ddh2o中，以制备10 mg/ml bsa溶液；
7、（2）将2 mg 80 nm 羧基修饰的pet加入450 μl mes（2-吗啉乙磺酸）缓冲液中使其溶解；
8、需要说明的是，除80 nm粒径的pet外，其他粒径、其他形态的pet均可用于偶联，均属于本专利保护范围。
9、（3）向450 μl pet溶液中分别加入200 μl bsa溶液，得到pet和bsa 或ova混合溶液；
10、（4）将pet-bsa或pet-ova混合溶液分别加入装有edc （10 mg） 的1.5 ml离心管中，放置于室温环境中的涡旋滚轴仪上10 rpm/min孵育3 h；
11、（5）通过在0.01 mol/l pbs （ph 7.2）中透析纯化偶联物以除去未反应的交联剂得到pet-bsa人工抗原。
12、需要说明的是，化合物与载体蛋白反应比例在5：1～50：1之间，除bsa外，其他载体蛋白，如ova、klh、has、btg、msa、rsa或pdl等，均属于本专利的保护范围，即分别制备得到pet-ova、pet-klh、pet-has、pet-btg、pet-msa、petrsa、pet-pdl人工抗原
13、本专利技术的第二个目的是提供一种抗pet禽源多克隆抗体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
14、（1）以pet-bsa为免疫抗原与弗氏完全佐剂按1：1混合后乳化，进行初次免疫；后用弗氏不完全佐剂与pet-bsa按1：1混合后乳化进行加强免疫；
15、（2）制备抗pet人工抗原的多克隆抗体，其中，向蛋鸡体内注射所述专利技术目的一得到的免疫抗原，收集所述禽类所生产的鸡蛋，做好标记后于4 ℃环境中保存；
16、（3）提取igy，其中，从上述收集的鸡蛋中将卵黄和卵清分离开后，提取igy多克隆抗体。
17、需要说明的是，所述制备免疫球蛋白方法包括：使用pet-bsa免疫抗原向21周龄蛋鸡进行初次免疫注射，免疫剂量为300 μg/只，初次免疫14天之后，进行3次加强免疫注射，每次加强免疫间隔时间为14天，免疫剂量为100-250 μg/只。
18、需要说明的是，使用peg6000沉淀法提取igy的方法，包括如下步骤：
19、（1）取四次免疫后获得的鸡蛋，分离出蛋黄，置于50 ml圆底离心管中，加入2倍体积的0.01mol/l pbs （ph 7.2） 进行稀释并充分混匀；充分混匀后边搅拌边加入3.5%（w/v）粉末状peg6000；
20、（2）将上述充分混匀的混合液放于涡旋滚轴仪上，以80~100 rpm/min摇30 min，而后静置10 min，于4 °c条件下，10000 rpm/min离心20 min；
21、（3）离心完成后，用滤纸过滤清亮色液体，并收集滤液至新的50 ml离心管中，丢弃滤纸沉淀；并在上清液中加入粉末状的peg6000，使其最终浓度达到8.5% （w/v），充分震荡混匀使peg6000完全溶解；
22、（4）将上述混合液放于室温环境中的涡旋滚轴仪上，以80-200 rpm/min摇30 min，室温静置10 min，在4 °c环境下，以转速10000 rpm/min离心20 min，收集沉淀；
23、（5）将沉淀重悬于10 ml pbs （ph 7.2），完全重悬后边搅拌边加入12% （w/v）peg6000，以80 rpm/min摇30 min，室温静置10 min，在4 °c环境下，以10000 rpm/min离心20 min，收集沉淀；
24、（6）用2 ml pbs溶解沉淀并混匀；将混合液放入透析袋内，用pbs （ph 7.2） 在4 °c环境中过夜透析；透析完成后将igy抗体溶液分装于离心管中，而后置于-80 °c保存。
25、需要说明的是，本专利不限于pbs （ph 7.2），ph值在7-8范围内的碳酸盐、tris-hcl或者其他盐的缓冲液等均可用于透析，均属于本专利保护范围。
26、本专利技术的第三个目的是建立一种用于检测pet含量的间接竞争酶联免疫检测方法，所述方法包括如下步骤：
27、（1）包被抗原：将pet-ova偶联物用0.01 mol/l的pbs （ph 7.2） 缓冲液配制成浓度为2 μg/ml，以100 μl/孔加入96孔酶标板中，4 °c过夜包被；
28、（2）封闭：弃除酶标板中包被液，每孔加入200 μl pbs-t洗液（含0.05%tween-20的0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种聚对苯二甲酸乙二醇酯人工抗原的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：
2.如权利要求1所述的聚对苯二甲酸乙二醇酯人工抗原的制备方法，其特征在于：步骤（1）使用OVA、KLH、HAS、BTG、MSA、RSA或PDL蛋白中的一种，即制备得到PET-OVA、PET-KLH、PET-HAS、PET-BTG、PET-MSA、PETRSA、PET-PDL人工抗原。
3.一种抗PET禽源多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的抗PET禽源多克隆抗体的制备方法，其特征在于：制备免疫球蛋白方法包括：使用PET-BSA免疫抗原向21周龄蛋鸡进行初次免疫注射，免疫剂量为300 μg/只，初次免疫14天之后，进行3次加强免疫注射，每次加强免疫间隔时间为14天，免疫剂量为100-250 μg/只。
5.如权利要求3所述的抗PET禽源多克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用PEG6000沉淀法提取IgY，包括如下步骤：
6.一种用于检测聚对苯二甲酸乙二醇酯的免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：
7.
...【技术特征摘要】
1.一种聚对苯二甲酸乙二醇酯人工抗原的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：
2.如权利要求1所述的聚对苯二甲酸乙二醇酯人工抗原的制备方法，其特征在于：步骤（1）使用ova、klh、has、btg、msa、rsa或pdl蛋白中的一种，即制备得到pet-ova、pet-klh、pet-has、pet-btg、pet-msa、petrsa、pet-pdl人工抗原。
3.一种抗pet禽源多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的抗pet禽源多克隆抗体的制备方法，其特征在于：制备免疫球...
【专利技术属性】
技术研发人员：张小莺，白华青，吴龙江，邓勤勤，党梅，
申请(专利权)人：陕西理工大学，
类型：发明
国别省市：
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