【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种评估靶基因dna甲基化程度的方法和应用。
技术介绍
1、dna甲基化成为分子生物学研究重要内容，也是疾病检测的新宠。表观遗传学研究发现，dna表观修饰在基因调控过程中具有重要的作用，而基因调控很大程度上是由基因表观修饰引起的，其中dna甲基化是表观修饰研究的热点。很长时间以来，基因异常主要集中于对其结构改变的研究，但基因的结构性改变通常位于基因表观调控异常之后，其发生的位点与出现的频率具有很大的不确定性，更多的是散发性。另外在肿瘤发生的早期，基因结构异常dna的占比很低，针对其检测则变得非常困难。研究表明，相对dna结构的改变，在基因异常检测中，基因表观修饰改变的范围与占比更大，而且发生的更早，对其检测可极大提高评判的敏感性，其中基因的甲基化由于可操作性强，已成为表观遗传学检测的亮点，并用于分子生物学研究的各个方面。所以研发出高效敏感的dna甲基化检测新方法，无疑将极大促进表观遗传学与分子生物学研究的进步。
2、目前常用的dna甲基化检测方法包括：高效液相色谱-紫外(hplc-uv)、因甲甲组基基化化dn特的a异检甲测性基尽p化c管r测有(序不m、e甲t同hy基的la化t方io敏法n-，感spe的绝ci限f大ic制多p性c数r内都，切是m酶基s-处p于c理亚r联)硫合、酸q盐甲pc处基r化理分，芯析片其等、原。d理全n为基a将dna甲基化修饰的不同转化为dna的结构不同，在此过程中非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不受影响，然后联合下游的检测方法对转化后的dna结构进行分
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种评估靶基因dna甲基化程度的方法和应用，具有简单、快速且结果准确可靠的特点。
2、本专利技术提供了一种评估靶基因dna甲基化程度的方法，包括以下步骤：
3、1)利用taq酶预混液体系、靶基因定量pcr检测的引物和探针配制定量pcr检测的反应体系，分别对靶基因进行较高温变性扩增和较低温变性扩增，得到较高温变性扩增的ctx-ht和较低温变性扩增的ctx-lh；
4、2)将步骤1)所述ct x-lh和所述ct x-ht带入公式i中，得到靶基因的△ctx；
5、△ctx＝ctx-lh–ctx-ht公式i
6、其中，△ctx表示x基因的检测值；ctx-lh表示x基因在较低温变性条件下扩增的ct值；ctx-ht表示x基因在较高温变性条件下扩增的ct值，x基因表示一种靶基因；
7、3)利用pcr技术和用于绘制参考曲线的试剂，通过碱基掺入制备不同程度的甲基化dna片段，稀释后作为pcr扩增的甲基化dna模板，按照步骤1)和步骤2)的方法操作，获得不同甲基化dna片段的△ctx'，得到不同比例甲基化胞嘧啶与δctx'之间的线性关系，绘制参考曲线；
8、4)将步骤2)中靶基因的δctx与步骤3)中参考曲线中δctx'进行比较，得到靶基因中甲基化胞嘧啶的比例，从而判断靶基因的dna甲基化程度；
9、所述较高温变性扩增的反应条件如下：95℃5min；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，45个循环；
10、所述较低温变性扩增的反应条件如下：85～88℃15s，60～62℃15s，72℃30s，18个循环；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，27个循环；
11、所述用于绘制参考曲线的试剂包括含有不同比例甲基化胞嘧啶的dntp试剂；所述含有不同比例甲基化胞嘧啶的dntp试剂包括等摩尔浓度的datp、dttp、dgtp和试剂a；所述试剂a为5'-m-dctp和/或dctp。
12、优选的，所述试剂a中，5'-m-dctp和dctp的摩尔比包括1：0、1：(1～30)和0：1。
13、优选的，所述靶基因包括但不限于以下一种或几种基因：
14、apc、shox2、apobec3b、p53、aid、hoxd12、alu、sdc2、wdr17和adhfe1。
15、优选的，所述用于绘制参考曲线的试剂还包括普通pcr扩增用试剂。
16、本专利技术还提供了上述技术方案所述方法在鉴定样本中靶基因的甲基化程度以及区分两个研究群体的dna甲基化变化中的应用。
17、本专利技术还提供一种基于靶基因组合中dna甲基化变化区分两个研究群体的方法，包括以下步骤：
18、利用上述技术方案所述的方法获得两个研究群体各靶基因的δct后，将研究群体1样品和研究群体2样品对应的各靶基因的δct进行统计学分析，得到靶基因联合检测的阈值和权重值，完成靶基因组合检测的建模；所述靶基因包括两种或两种以上靶基因；
19、所述权重值是将各靶基因的δct带入公式ii中，计算得到各样品的多靶基因联合检测的权重值；
20、多靶基因联合检测的权重值＝a1×△ctx1+a2×△ctx2+......+an×△ctxn公式ii其中，a1、a2、an分别表示各靶基因统计学分析时得到的对应系数；
21、两群体差异的验证：未参与建模的研究群体1样品和研究群体2样品按照上述方法获得多靶基因权重值，然后分别与上述阈值进行比较，权重值低于阈值的样品为低甲基化样本，权重值高于阈值的样品为高甲基化样本，进一步经统计学分析比较两群体之间差异；
22、两群体之间的差异性判定：将计算研究群体1样品和研究群体2样品的权重值的均值，进行t检验分析，当研究群体1样品的权重值的均值和研究群体2样品的权重值的均值呈显著性差异，表明两群体的dna甲基化差异显本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种评估靶基因DNA甲基化程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂A中，5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比包括1：0，1：(1～30)和0：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶基因包括但不限于以下一种或几种基因：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于绘制参考曲线的试剂还包括普通PCR扩增用试剂。
5.权利要求1～4任一项所述的方法在鉴定样本中靶基因的甲基化程度以及区分两个研究群体的中的应用。
6.一种基于靶基因组合中DNA甲基化变化区分两个研究群体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.基于权利要求1～4任一项所述的方法或权利要求6所述的方法制备区分癌症患者和非癌患者的产品的应用；
【技术特征摘要】
1.一种评估靶基因dna甲基化程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂a中，5'-m-dctp和dctp的摩尔比包括1：0，1：(1～30)和0：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶基因包括但不限于以下一种或几种基因：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于...
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