【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，尤其涉及糖基转移酶突变体及其在催化酪醇制备红景天苷中的应用。
技术介绍
1、红景天苷是红景天中的主要药用成分。临床研究结果表明，红景天苷不但具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等主要功能，而且还具有增强注意力、提高工作效率、延缓机体衰老、防止老年疾病等功效，尤其在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物，近年来备受关注。红景天苷无毒无害，可直接作为天然保健食品或药品，也可添加到焙烤制品、肉制品、面制品、乳制品、果冻、饮料等几乎大部分食品中。红景天苷在化妆品、饲料添加剂方面也有很好的市场前景。
2、红景天苷目前的生产方式主要有植物提取和化学合成两种。红景天生长于高寒无污染地区，野生资源珍稀，红景天苷含量很低，采用植物提取方法会破坏红景天野生的植物资源，且价格昂贵。而采用化学合成方法需要选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂等，成本较高，容易造成环境污染。
3、糖基转移酶(glycosyltransferases,gt；ec 2.4.x.y)是一类能够催化糖基部分从活化的糖基供体分子转移到特定糖基受体分子并形成糖苷键的酶。催化的糖基化反应是合成结构复杂多样同时具有生理活性功能的糖苷类化合物的关键步骤。相比化学法，糖基转移酶所介导的糖基化反应无需繁琐的保护与脱保护，无需使用红磷、溴素等对人体和环境具有危害作用的催化剂，是一种对环境友好的生物修饰方法。因此，通过糖基转移酶糖基化酪醇合成红景天苷，在有机合成领域受到越
技术实现思路
1、本专利技术针对微生物糖基转移酶区域选择性低的问题，通过对底物结合口袋处的氨基酸进行定点饱和突变，获得了一类对酪醇的醇羟基具有高度选择性的糖基转移酶突变体，显著提高了红景天苷的得率。
2、为解决上述技术问题，本专利技术的第一个目的，提供一种糖基转移酶突变体，具体如下：
3、将seq id no.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸突变为亮氨酸，氨基酸序列如seq id no.2所示；或
4、将seq id no.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸和第325位异亮氨酸分别突变为亮氨酸和酪氨酸，氨基酸序列如seq id no.3所示；或
5、将seq id no.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸和第70位亮氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸和精氨酸，氨基酸序列如seq id no.4所示；或
6、将seq id no.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸和第136位的谷氨酰胺分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸和谷氨酸，氨基酸序列如seqid no.5所示；或
7、将seq id no.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸、第136位的谷氨酰胺和第67位的异亮氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酸，氨基酸序列如seq id no.6所示；或
8、将seq id no.1所示氨基酸序列的第112位甲硫氨酸、第325位异亮氨酸、第70位亮氨酸、第136位的谷氨酰胺、第67位的异亮氨酸和第77位的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酸和精氨酸，氨基酸序列如seq id no.7所示。
9、本专利技术的提二个目的，提供一种编码权利要求1所述糖基转移酶突变体的基因。
10、本专利技术的第三个目的，提供一种携带权利要求2所述基因的表达载体。
11、本专利技术的第四个目的，提供一种表达上述糖基转移酶突变体、或携带上述基因或上述表达载体的微生物。
12、作为一个具体实施例，所述微生物包括但不限于基因工程菌。
13、本专利技术的第五个目的，提供一种上述的糖基转移酶突变体、或上述的基因、或上述的表达载体、或者上述的微生物在红景天苷合成中的应用。
14、作为一个具体实施例，红景天苷的合成过程如下：
15、在udp-葡萄糖循环系统提供的udp-葡萄糖存在下，底物酪醇在糖基转移酶突变体催化下发生糖基化反应生成红景天苷。具体地，首先制备糖基转移酶突变体的酶液，将酶液或能表达糖基转移酶突变体的基因工程菌加入底物酪醇中，与udp-葡萄糖循环系统混合，在混合体系中进行糖基化反应，制备获得红景天苷。
16、其中，反应温度为15～50℃，反应体系的ph值为6～10，udp-葡萄糖浓度为0～2mm。
17、酶液可以为表达所述糖基转移酶突变体的基因工程菌的破胞粗酶液或纯化后的酶液。
18、udp-葡萄糖循环系统具体循环过程如下：在udp存在的条件下，蔗糖由蔗糖合成酶催化生成葡萄糖、果糖和udp-葡萄糖，生成的udp-葡萄糖再次参与红景天苷的合成。蔗糖浓度为0～600mm。
19、本专利技术所达到的有益技术效果：本专利技术所采用的糖基转移酶为微生物来源，相比于植物来源糖基转移酶，本专利技术的糖基转移酶更容易在大肠杆菌等模式菌株高效可溶性表达；本专利技术获得的糖基转移酶突变体对酪醇的区域选择性显著提高，由野生型51％提高到99％以上，能够生成单一的糖基化产物红景天苷；此外，本专利技术微生物糖基转移酶突变体对酪醇的催化活力显著提高，比酶活由野生型的14mu/mg提高到97mu/mg，底物转化率高于99％；本专利技术成功的解决了红景天苷制备过程中的糖基转移酶表达难、区域选择性低、活力低的关键问题，表现出非常大的工业应用前景。
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1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于：
2.编码权利要求1所述糖基转移酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.表达权利要求1所述糖基转移酶突变体、或携带权利要求2所述基因或权利要求3所述表达载体的微生物。
5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于：所述微生物为基因工程菌。
6.权利要求1所述的糖基转移酶突变体、或权利要求2所述的基因、或权利要求3所述的表达载体、或者权利要求4-5任一项所述的微生物在红景天苷合成中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在UDP-葡萄糖循环系统提供的UDP-葡萄糖存在下，底物酪醇在糖基转移酶突变体催化下发生糖基化反应生成红景天苷。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，UDP-葡萄糖循环系统具体循环过程如下：在UDP存在的条件下，蔗糖由蔗糖合成酶催化生成葡萄糖、果糖和UDP-葡萄糖，生成的UDP-葡萄糖再次参与红景天苷的合成。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：反应温度为15～50℃，反应体系的pH值为6～
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：蔗糖浓度为0～600 mM。
...【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于：
2.编码权利要求1所述糖基转移酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.表达权利要求1所述糖基转移酶突变体、或携带权利要求2所述基因或权利要求3所述表达载体的微生物。
5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于：所述微生物为基因工程菌。
6.权利要求1所述的糖基转移酶突变体、或权利要求2所述的基因、或权利要求3所述的表达载体、或者权利要求4-5任一项所述的微生物在红景天苷合成中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在...
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