【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及酶工程。更具体地，涉及热稳定性提高的β-半乳糖苷酶突变体及其应用。
技术介绍
1、乳糖不耐受症是一种较为普遍的生理性问题，具体表现为患者饮用含乳糖的乳制品后，由于自身无法分解其中的乳糖，进而导致肠鸣、腹痛和腹泻等不良反应。预先利用乳糖酶降解乳制品中的乳糖，可有效解决乳糖不耐受的问题。
2、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，ec.3.2.1.23)简称乳糖酶，是一种重要的糖苷水解酶，能够将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，在食品工业有广泛的应用。目前应用于低/无乳糖乳制品生产的乳糖酶主要是常温乳糖酶，其最适温度在37℃左右，该温度非常适合微生物生长、繁殖，使乳制品的安全风险增加。如果采用低温水解法(即冷藏条件(4℃)下加入乳糖酶)，虽能减少微生物污染，但低温条件下乳糖酶的水解效率低，使得乳制品生产周期延长、能耗增大、成本增加。若采用高温水解，虽可以有效解决上述问题，但相应的，对乳糖酶热稳定性的要求会更高。因此，需要热稳定性更好的乳糖酶。此外，在水解牛奶中的乳糖时，乳糖酶的最适反应温度也并非越高越好，一般认为55～65℃比较适宜，过高的水解温度会导致牛奶风味和色泽的改变，并且不能配合巴氏杀菌条件。在乳糖酶热稳定性好的基础上，若能提供一种最适反应温度适中且乳糖水解活性高的乳糖酶，更有利于低/无乳糖乳制品的生产。
3、目前虽有关于通过氨基酸突变提高乳糖酶热稳定性的报道，但不同乳糖酶的氨基酸序列不同，并没有提高其热稳定性的通用方法。
技术实现思路p>
1、本专利技术要解决的技术问题是克服现有用于提高野生型β-半乳糖苷酶bgal1-3热稳定性的方法的缺陷和不足，提供热稳定性提高的β-半乳糖苷酶突变体及其应用。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种提高β-半乳糖苷酶热稳定性的方法。
3、本专利技术的第二个目的是提供一种热稳定性提高的β-半乳糖苷酶突变体。
4、本专利技术的第三个目的是提供一种编码所述β-半乳糖苷酶突变体的基因。
5、本专利技术的第四个目的是提供一种含有编码所述β-半乳糖苷酶突变体的基因的重组载体。
6、本专利技术的第五个目的是提供一种含有所述重组载体的重组菌。
7、本专利技术的第六个目的是提供所述β-半乳糖苷酶突变体、所述基因、所述重组载体或所述重组菌在降解乳糖中的应用。
8、本专利技术的第七个目的是提供所述β-半乳糖苷酶突变体、所述基因、所述重组载体或所述重组菌在制备降解乳糖的制剂中的应用。
9、本专利技术的第八个目的是提供所述β-半乳糖苷酶突变体、所述基因、所述重组载体或所述重组菌在生产低乳糖或无乳糖乳制品中的应用。
10、本专利技术的第九个目的是提供所述β-半乳糖苷酶突变体、所述基因、所述重组载体或所述重组菌在制备用于生产低乳糖或无乳糖乳制品的制剂中的应用。
11、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
12、β-半乳糖苷酶bgal1-3具有将牛奶中的乳糖彻底水解为葡萄糖和半乳糖的优良特性，但其热稳定性较差。本专利技术以野生型β-半乳糖苷酶bgal1-3为亲本，通过对其特定位点的氨基酸进行单点突变和组合突变，获得了热稳定性提高的β-半乳糖苷酶突变体。除热稳定性提高外，部分突变体的乳糖酶活性也得以提升，可以在高温(55～65℃)条件下，快速水解牛奶中的乳糖，良好的热稳定性使本专利技术所述β-半乳糖苷酶突变体在生产低/无乳糖乳制品方面具有巨大的应用潜力。因此，本专利技术请求保护所述β-半乳糖苷酶突变体及其应用。
13、本专利技术提供了一种提高β-半乳糖苷酶热稳定性的方法，所述方法为：对β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的第66、80、277、378、396、398、414、418、462、552、578、613、632、633、676、689位的氨基酸中的一个或多个进行突变。
14、具体地，本专利技术所述β-半乳糖苷酶为β-半乳糖苷酶bgal1-3，其氨基酸序列如seqid no.1所示，其基因序列如seq id no.2所示，genbank：kc521353。
15、具体地，所述提高β-半乳糖苷酶热稳定性的方法为：
16、将第66位丙氨酸(ala)突变为缬氨酸(val)；
17、或将第80位谷氨酰胺(gln)突变为甘氨酸(gly)；
18、或将第277位丝氨酸(ser)替换为甲硫氨酸(met)；
19、或将第277位丝氨酸(ser)替换为缬氨酸(val)；
20、或将第378位缬氨酸(val)替换为苏氨酸(thr)；
21、或将第396位缬氨酸(val)替换为丙氨酸(ala)；
22、或将第398位酪氨酸(tyr)替换为半胱氨酸(cys)；
23、或将第398位酪氨酸(tyr)替换为天冬酰胺(asn)；
24、或将第414位苯丙氨酸(phe)替换为酪氨酸(tyr)；
25、或将第418位天冬酰胺(asn)替换为丝氨酸(ser)；
26、或将第462位谷氨酸(glu)替换为谷氨酰胺(gln)；
27、或将第462位谷氨酸(glu)替换为甘氨酸(gly)；
28、或将第552位天冬酰胺(asn)替换为天冬氨酸(asp)；
29、或将第578位赖氨酸(lys)替换为精氨酸(arg)；
30、或将第613位丝氨酸(ser)替换为脯氨酸(pro)；
31、或将第632位天冬氨酸(asp)替换为苏氨酸(thr)；
32、或将第633位苯丙氨酸(phe)替换为亮氨酸(leu)；
33、或将第676位丝氨酸(ser)替换为苯丙氨酸(phe)；
34、或将第689位精氨酸(arg)替换为亮氨酸(leu)；
35、或将第462位谷氨酸(glu)突变为谷氨酰胺(gln)、第676位丝氨酸(ser)突变为苯丙氨酸(phe)；
36、或将第277位丝氨酸(ser)突变为缬氨酸(val)、第462位谷氨酸(glu)突变为谷氨酰胺(gln)、第676位丝氨酸(ser)突变为苯丙氨酸(phe)；
37、或将第277位丝氨酸(ser)突变为缬氨酸(val)、第462位谷氨酸(glu)突变为谷氨酰胺(gln)、第676位丝氨酸(ser)突变为苯丙氨酸(phe)、第689位(arg)突变为亮氨酸(leu)；
38、或将第277位丝氨酸(ser)突变为缬氨酸(val)、第462位谷氨酸(glu)突变为谷氨酰胺(gln)、第578位赖氨酸(lys)突变为精氨酸(arg)、第676位丝氨酸(ser)突变为苯丙氨酸(phe)、第689位精氨酸(arg)突变为亮氨酸(leu)；
39、或将第277位丝氨酸(ser)突变为缬氨酸(val)、第398位酪氨酸(tyr)突变为半胱氨酸(cys)、第462位谷氨酸(glu)突变为谷氨酰本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高β-半乳糖苷酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为：对β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的第66、80、277、378、396、398、414、418、462、552、578、613、632、633、676、689位的氨基酸中的一个或多个进行突变；所述β-半乳糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法为：
3.一种热稳定性提高的β-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是利用权利要求1或2所述方法得到。
4.一种编码权利要求3所述β-半乳糖苷酶突变体的基因。
5.一种含有权利要求4所述基因的重组载体。
6.一种含有权利要求5所述重组载体的重组菌。
7.权利要求3所述β-半乳糖苷酶突变体、权利要求4所述基因、权利要求5所述重组载体或权利要求6所述重组菌在降解乳糖中的应用。
8.权利要求3所述β-半乳糖苷酶突变体、权利要求4所述基因、权利要求5所述重组载体或权利要求6所述重组菌在制备降解乳糖的制剂中的应用。
9.权利要求3所述β
10.权利要求3所述β-半乳糖苷酶突变体、权利要求4所述基因、权利要求5所述重组载体或权利要求6所述重组菌在制备用于生产低乳糖或无乳糖乳制品的制剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高β-半乳糖苷酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为：对β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的第66、80、277、378、396、398、414、418、462、552、578、613、632、633、676、689位的氨基酸中的一个或多个进行突变；所述β-半乳糖苷酶氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法为：
3.一种热稳定性提高的β-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是利用权利要求1或2所述方法得到。
4.一种编码权利要求3所述β-半乳糖苷酶突变体的基因。
5.一种含有权利要求4所述基因的重组载体。
6.一种含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉焕，曹立创，张素芳，黄磊，杨向鹏，卫雅萱，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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