【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种利用花药诱导的愈伤组织为受体建立枣遗传转化体系的方法。
技术介绍
1、枣（ziziphus jujuba mil.）原产于中国，种质资源丰富，栽培历史悠久，已成为我国第一大干果树种，具有重要的经济、药用和观赏价值。但是由于枣树胚败育率较高、花小且去雄困难、落花落果严重，大大限制了杂交育种在枣树新品种培育上的应用，至今人们对枣树的遗传背景和基因功能信息仍了解甚少。
2、2014年，河北农业大学刘孟军课题组在世界上率先完成了枣全基因组测序，组装基因组437.65mb，注释基因32808个。基于此，大量调控重要性状形成的候选关键基因被相继报道。但是，相比较其它植物的遗传转化研究，枣树的转基因工作仍在探索阶段，关于稳定遗传转化体系鲜有报道。
3、因此，有必要建立一套高效的愈伤组织遗传转化体系的方法，解决在枣树遗传改良和基因功能鉴定方面的问题，从而加速枣功能基因的研究进程。这对在枣本体相关功能基因的表达体系研究意义重大。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种利用花药诱导愈伤组织为受体建立枣遗传转化体系的方法，该方法转化频率高，重复性高，且借助荧光标记方法实现了可视化快速鉴定，为枣基因功能解析提供了便利，同时也为枣的遗传改良提供了可能。
2、本专利技术的技术方案具体如下所示：
3、一种利用花药诱导愈伤组织为受体的枣遗传转化方法，包括以下步骤：
4、（i）对无菌花药进行培养得到愈伤组织；>
5、（ii）构建含有目的基因的植物重组过表达载体并转入农杆菌，获得农杆菌浸染液；
6、（iii）将愈伤组织与农杆菌浸染液黑暗共培养，再将沥干的愈伤组织置于黑暗条件下培养；
7、（iv）将（iii）培养的愈伤置于潮霉素培养基筛选培养，得到纯合的抗性愈伤。
8、优选地，在上述枣遗传转化方法中，还包括以下步骤：
9、（v）利用纯合的抗性愈伤，对目的基因的表达量和基因功能进行分析。
10、优选地，在上述枣遗传转化方法中，所述枣为京39枣。京39枣果实大小适中、皮薄，肉质松脆，汁多味甜，且高产，抗病，耐旱，为枣优良品种。本专利技术的一实施例中，利用京39枣花药诱导的愈伤组织为受体建立了一个高效的京39枣高效遗传转化体系，填补了京39枣花药愈伤组织的遗传转化的技术空白。
11、优选地，在上述枣遗传转化方法中，步骤（i）中所述无菌花药的获取方法为：从生长健壮、无病虫害的植株上选取花蕾，对花蕾依次用70%酒精和0.1%氯化汞处理，然后剥去花瓣即得。
12、优选地，在上述枣遗传转化方法中，步骤（i）所述培养的方式为：将无菌花药接种至诱导培养基上，26℃暗培养30d，再将诱导成功的愈伤组织转移至增殖培养基上培养，且光照周期为16/8h，培养温度为26℃；其中，诱导培养基（ph=5.8）为4.43g/l 1/2ms+1.0mg/l2,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg/l噻苯隆+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂；增殖培养基（ph=5.8）为4.43g/l ms+1.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg/l噻苯隆+30g/l蔗糖+8.0g/l琼脂。
13、优选地，在上述枣遗传转化方法中，所述植物重组过表达载体为含有目的基因的ph7wg2d质粒，且所述ph7wg2d质粒携带有35s启动子、egfp标签、壮观霉素和潮霉素抗性基因。实验表明，该质粒相对于其他质粒能够显著改善愈伤遗传转化率，如采用pk7wg2d质粒（携带有35s启动子、egfp标签、壮观霉素和卡那霉素抗性基因）时愈伤遗传转化率基本为0。
14、优选地，在上述枣遗传转化方法中，步骤（ii）所述农杆菌浸染液由携带有植物重组过表达载体的农杆菌和重悬液组成，其中重悬液为：4.43g/l ms+30g/l蔗糖+100mm乙酰丁香酮。
15、优选地，在上述枣遗传转化方法中，步骤（iii）所述培养的方式为：将沥干农杆菌浸染液的愈伤组织置于固体ms共培养基上，于黑暗条件下共培养2-3天；其中，所述固体ms共培养基为4.43g/l ms+1.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg/l噻苯隆+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+100mm乙酰丁香酮。
16、优选地，在上述枣遗传转化方法中，步骤（iv）所述筛选培养的方式为：用含有潮霉素的培养基进行愈伤培养。其中，筛选培养基为4.43g/l ms+1.0mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg/l噻苯隆+30g/l蔗糖+8g/l琼脂+50mg/l潮霉素。
17、优选地，在上述枣遗传转化方法中，步骤（iv）所述获得纯合抗性愈伤的方法为：将具有荧光标记的愈伤组织单独置于筛选培养基中，经过2-3代、每代3-4周的筛选培养后，即可得到。
18、本专利技术的有益效果为：
19、本专利技术利用京39枣花药诱导的愈伤组织为受体，建立了京39枣遗传转化体系的方法，完善了枣花药愈伤组织的遗传转化研究。而且本专利技术方法的转化频率较高，可重复性高，操作步骤简单，同时借助35s::egfp荧光报告基因标记辅助筛选，方便快捷。本专利技术建立的京39枣遗传转化体系为枣基因功能解析提供了便利，同时也加速了枣功能基因的研究进程。
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1.一种利用花药诱导愈伤组织为受体的枣遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，还包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，所述无菌花药的获取方法为：从生长健壮、无病虫害的植株上选取花蕾，对花蕾依次用酒精和氯化汞处理，然后剥去花瓣即得。
4.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，步骤（i）所述培养的方式为：将无菌花药接种至诱导培养基上，26℃暗培养30d，再将诱导成功的愈伤组织转移至增殖培养基上培养，且光照周期为16/8h，培养温度为26℃；
5.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，所述植物重组过表达载体为含有目的基因的pH7WG2D质粒，且所述pH7WG2D质粒携带有35S启动子、EGFP标签、壮观霉素和潮霉素抗性基因。
6. 根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，步骤（ii）所述农杆菌浸染液由携带有植物重组过表达载体的农杆菌和重悬液组成，所述重悬液为4.43g/L MS+30g/L蔗糖+100mM乙酰丁香酮。
7. 根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，步骤（iii）所述培养的方式为：将沥干农杆菌浸染液的愈伤组织置于固体MS共培养基上，于黑暗条件下共培养2-3天；其中，所述固体MS共培养基为4.43g/L MS+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg/L噻苯隆+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+100mM乙酰丁香酮。
8. 根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，步骤（iv）所述筛选培养基培养的方法为：用含有潮霉素的筛选培养基进行培养；所述筛选共培养基为4.43g/L MS+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+0.5mg/L噻苯隆+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+50mg/L潮霉素。
9.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，步骤（iv）所述获得纯合的抗性愈伤方式为：将具有荧光标记的愈伤组织单独置于固体MS筛选培养基中，经过2-3代、每代3-4周的筛选培养后，即可得到。
10.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，所述枣为京39枣。
...【技术特征摘要】
1.一种利用花药诱导愈伤组织为受体的枣遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，还包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，所述无菌花药的获取方法为：从生长健壮、无病虫害的植株上选取花蕾，对花蕾依次用酒精和氯化汞处理，然后剥去花瓣即得。
4.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，步骤（i）所述培养的方式为：将无菌花药接种至诱导培养基上，26℃暗培养30d，再将诱导成功的愈伤组织转移至增殖培养基上培养，且光照周期为16/8h，培养温度为26℃；
5.根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，所述植物重组过表达载体为含有目的基因的ph7wg2d质粒，且所述ph7wg2d质粒携带有35s启动子、egfp标签、壮观霉素和潮霉素抗性基因。
6. 根据权利要求1所述的枣遗传转化方法，其特征在于，步骤（ii）所述农杆菌浸染液由携带有植物重组过表达载体的农杆菌和重悬液组成，所述重悬液为4.43g/l ms+30g/...
【专利技术属性】
技术研发人员：王江波，童盼盼，冯一峰，郭俊娇，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：
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