【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种生物合成乙醛酸的方法。
技术介绍
1、一碳(c1)化合物包括co2、co、甲酸、甲醛和甲醇等，具有来源广泛、价值低廉等特点，是公认最理想的工业生物制造原料。自然生物通常用循环途径进行一碳利用，如卡尔文循环、丝氨酸循环、木酮糖单磷酸循环和核酮糖单磷酸循环等，然而天然的循环固碳途径往往存在途径复杂、效率低下、原子经济性差等问题。线性、正交的固碳路径被认为是最有潜力的固碳路径。以近几年发现的还原甘氨酸途径为例，其核心固碳酶是甘氨酸裂解体系(glycine cleavage system，gcs)，其可以逆向利用co2、5，10-亚甲基四氢叶酸和氨(nh3)合成甘氨酸。甘氨酸裂解体系是由三个酶(p蛋白、t蛋白、l蛋白)和一个载体h蛋白组成的多酶复合体，通过载体h蛋白上硫辛酰赖氨酸臂作为活性亲核基团，接受并转移co2。还原甘氨酸途径为被认为是固碳途径中最具优势的途径之一，反应步骤较少，atp需求较低，途径中的酶对氧气的耐受性比较好，对中心代谢干扰小，有较好的工业应用潜力。最近还原甘氨酸途径在e.coli、saccharomyces cerevisiae、clostridium drakei等微生物中获得成功表达，使得宿主细胞可以利用甲酸和co2合成有机酸及氨基酸等初级代谢产物。
2、地球上的一碳资源丰富，2013年全球甲醛产能约6400万吨，全球甲醇产能约10324万吨，天然气可采储量约185.7万亿立方米，原煤可采储量约8915.31亿吨。自然界没有酶能够催化甲醛与二氧化碳
技术实现思路
1、为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种生物合成乙醛酸的方法。本专利技术将苯甲酰甲酸脱羧酶(bfd,pseudomonas putida)的突变体(w86r,n87t,l109g,l110e,a460m,h281v,q282f)用于缩合甲醛与二氧化碳，反应生成乙醛酸。乙醛酸既可以通过甘油酸路径进入中心代谢，也可以转化为甘氨酸，构建人工甘氨酸路径。因此，本专利技术将为一碳资源的高效利用奠定基础。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案施行：
3、第一方面，本专利技术提供了一种生物合成乙醛酸的方法，包括：甲醛和二氧化碳在羟基乙醛合成酶(gals)、和/或其突变体或具有此催化功能的酶的作用下合成乙醛酸；
4、根据本专利技术的实施方案，其中所述羟基乙醛合成酶或其突变体可以为苯甲酰甲酸脱羧酶(bfd,pseudomonas putida)进行定向进化后获得的bfd突变体。
5、根据本专利技术的实施方案，其中所述bfd突变体选自如下任一种：
6、(a)其氨基酸序列由seq id no:1所示序列突变而来，在如下的位点突变：w86r、n87t、l109g、l110e、a460m、h281v和q282f；
7、或
8、(b)所述bfd突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述bfd突变体的功能；
9、或
10、(c)所述bfd突变体由在(a)所述的氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而组成，并且具有(a)所述甲醇脱氢酶突变体的功能；
11、应理解，在本专利技术的上下文中，羟基乙醛合成酶(gals)均具有以上定义的氨基酸序列。
12、根据本专利技术的实施方案，其中所用的羟基乙醛合成酶可以为纯化的酶、酶裂解上清液或全细胞的形式。
13、根据本专利技术的实施方案，所述方法可以以“一锅法”方式进行，可在缓冲液体系中进行。所述缓冲液可为碳酸氢钠/碳酸氢钾/碳酸氢铵缓冲液。所述缓冲液的ph值可为8.5-9.5，例如ph为9。所述缓冲液示例性地为碳酸氢钠缓冲液，ph值为9。
14、根据本专利技术的实施方案，所述底物甲醛在反应体系中的浓度可为10-100mm，例如，示例性地为50mm。
15、根据本专利技术的实施方案，所述缓冲液体系中还包含辅因子硫胺素焦磷酸(tpp)，起反应催化剂的作用。
16、根据本专利技术的实施方案，其中所用的羟基乙醛合成酶的浓度可为1-5mg/ml，例如，示例性地为2mg/ml。
17、根据本专利技术的实施方案，所述“一锅法”反应可在30-40℃下进行，例如，示例性地为37℃。
18、根据本专利技术的实施方案，所述“一锅法”反应可在0.5-3小时进行，例如，示例性地为1小时。
19、根据本专利技术的实施方案，所述“一锅法”反应，反应结束后，反应体系中加入等体积乙腈，蛋白变性沉淀，12000rpm离心1h，取上清检测乙醛酸。
20、第二方面，本专利技术提供第一方面所述的羟基乙醛合成酶或其突变体或相关生物材料在生物合成乙醛酸中的应用。
21、根据本专利技术的实施方案，上述羟基乙醛合成酶或其突变体或相关生物材料用于以甲醛和二氧化碳为底物生物合成乙醛酸。
22、根据本专利技术的实施方案，所述羟基乙醛合成酶的相关生物材料为能够表达所述羟基乙醛合成酶的编码核酸分子，或者含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
23、根据本专利技术的实施方案，所述重组菌为将编码所述羟基乙醛合成酶、其突变体的核酸分子导入宿主细胞中得到的重组菌；例如以重组载体的形式导入宿主细胞中。
24、其中，所述重组载体为携带编码所述羟基乙醛合成酶、其突变体的核酸分子的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。
25、其中，所述宿主细胞可以为原核细胞如细菌，更具体如大肠杆菌，或者低等真核细胞如酵母细胞。
26、在本专利技术的上下文中，氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：a：ala(丙氨酸)；r：arg(精氨酸)；n：asn(天冬酰胺)；d：asp(天冬氨酸)；c：cys(半胱氨酸)；q：gln(谷氨酰胺)；e：glu(谷氨酸)；g：gly(甘氨酸)；h：his(组氨酸)；i：ile(异亮氨酸)；l：leu(亮氨酸)；k：lys(赖氨酸)；m：met(甲硫氨酸)；f：phe(苯丙氨酸)；p：pro(脯氨酸)；s：ser(丝氨酸)；t：thr(苏氨酸)；w：trp(色氨酸)；y：tyr(酪氨酸)；v：val(缬氨酸)。
27、在本专利技术的上下文中，突变体根据它们在特定残基上的突变来描述，其位置通过与野生型酶序列比对或参考野生型酶酶序列来确定。在本专利技术的上下文中，还涉及在功能等同的残基上携带这些相同突变的任何变体。
28、在本文中，通过突变位点的位置编号和该位点的氨基酸种类来表达突变位点及其取代，例如w86r表示与seq id no:1比对，在对应于seq id no:1第86位置的色氨酸突变为精氨酸；n87本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种羟基乙醛合成酶或其突变体或相关生物材料在以甲醛和二氧化碳为底物生物合成乙醛酸中的应用，其特征在于，所述羟基乙醛合成酶或其突变体可以为苯甲酰甲酸脱羧酶进行定向进化后获得的BFD突变体，其中所述BFD突变体选自如下任一种：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羟基乙醛合成酶的相关生物材料为能够表达所述羟基乙醛合成酶的编码核酸分子，或者含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组载体为携带编码所述羟基乙醛合成酶、其突变体的核酸分子的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组菌为将编码所述羟基乙醛合成酶、其突变体的核酸分子导入宿主细胞中得到的重组菌；例如以重组载体的形式导入宿主细胞中；
5.一种生物合成乙醛酸的方法，包括：甲醛和二氧化碳在羟基乙醛合成酶(GALS)、和/或其突变体或具有此催化功能的酶的作用下合成乙醛酸；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法可以以“一锅法”方式
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述底物甲醛在反应体系中的浓度可为10-100mM，例如，示例性地为50mM。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液体系中还包含辅因子硫胺素焦磷酸(TPP)作为反应催化剂。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所用的羟基乙醛合成酶的浓度可为1-5mg/mL，例如，示例性地为2mg/mL。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述“一锅法”反应可在30-40℃下进行，例如，示例性地为37℃。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述“一锅法”反应可在0.5-3小时进行，例如，示例性地为反应1小时。
12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述“一锅法”反应，反应结束后，反应体系中加入等体积乙腈，蛋白变性沉淀，5000-15000rpm离心0.5-3h，取上清检测乙醛酸。
...【技术特征摘要】
1.一种羟基乙醛合成酶或其突变体或相关生物材料在以甲醛和二氧化碳为底物生物合成乙醛酸中的应用，其特征在于，所述羟基乙醛合成酶或其突变体可以为苯甲酰甲酸脱羧酶进行定向进化后获得的bfd突变体，其中所述bfd突变体选自如下任一种：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羟基乙醛合成酶的相关生物材料为能够表达所述羟基乙醛合成酶的编码核酸分子，或者含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组载体为携带编码所述羟基乙醛合成酶、其突变体的核酸分子的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组菌为将编码所述羟基乙醛合成酶、其突变体的核酸分子导入宿主细胞中得到的重组菌；例如以重组载体的形式导入宿主细胞中；
5.一种生物合成乙醛酸的方法，包括：甲醛和二氧化碳在羟基乙醛合成酶(gals)、和/或其突变体或具有此催化功能的酶的作用下合成乙醛酸；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法可以以“一锅法”方式进行，...
【专利技术属性】
技术研发人员：江会锋，刘玉万，刘丁玉，赵浩东，卢丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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