【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测领域，特别涉及一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物、试剂盒和方法。
技术介绍
1、随着养殖规模的扩大，对虾疫病呈现感染病原体的多样化，已成为困扰对虾养殖业绿色发展的一个重要问题。近十年对虾养殖过程中常见的主要病原体包括：传染性皮下和造血器官坏死病毒(ihhnv)、对虾白斑病毒(white spot syndrome virus,wssv)毒株、十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus1,div1)毒株、虾肝肠胞虫(enterocytozoonhepatopenaei，ehp)和致急性肝胰腺坏死病弧菌(acute hepatopancreatic necrosisdisease causing vibrio,vp ahpnd)等。
2、ihhnv自1981年在美国夏威夷地区的细角滨对虾(penaeus stylirostris)中首次发现以来[1]，在世界范围内迅速传播，现广泛分布于全球各种野生下和养殖虾中[2,3]，常见于东南亚对虾(斑节对虾)和美洲野生对虾(南美白对虾、蓝对虾和其他太平洋沿岸野生对虾)[4]。对虾感染ihhnv后首先出现的迹象是嗜睡，然后是静止不动，倒立沉入底部，肌肉不透明，无活动性或者死亡[5]。此外，有些感染ihhnv的对虾不出现明显的临床症状，但可作为传染源存在于群体中[6]。感染群体还会出现引起矮小残缺综合征(runt-deformitysyndrome，rds)，主要影响为生长缓慢，表皮畸变，但无死亡。基于以上病
3、作为世界上危害最严重的对虾病毒之一，ihhnv给对虾养殖造成了巨大负面影响[8]。世界动物卫生组织(woah)已将传染性皮下和造血组织坏死病列为必须申报的甲壳类重要疫病之一。感染ihhnv的不同种类个体症状不相同，但大部分以慢性感染为主，严重时会引起死亡，致死率可达90％[9]。目前ihhnv感染尚无有效治疗方法，一旦发生大规模的感染情况，难以在第一时间内便采取有效措施进行控制，极易造成巨大的经济损失和连锁影响，因此定期检测和早期诊断是至关重要的。
4、现行的检测方法主要采取生物学方法，传统的显微镜镜检、细菌培养等方法已经逐渐被取代。目前ihhnv的检测主要采用gb/t 25878-2010中的普通pcr方法，进出口对虾中ihhnv的诊断检疫多使用sn/t 1673-2013中的荧光pcr方法。lamp技术作为新型的常温检测技术也逐渐被应用。葛辉等开发了可视化环介导等温扩增(lamp)技术方法，最低检出限为10.3copies/μl[10]。但可视化lamp引物设计复杂，假阳性较多，可视化判定极易造成人为判读的主观误差，在实际检测中均存在一定的缺陷。
5、基于crispr技术在检测成本、效率、便携性和特异性等方面的优势，逐步在动物疫病检测方面得到应用，但目前此方法在水生疫病检测中的应用较少见。近年来，研究报道虾病共感染情况普遍存在。胡文娟等人于2014年对上海地区部分淡水养殖凡纳滨对虾wssv和ihhnv的感染及共感染情况进行了跟踪、检测和人工感染分析，检测结果显示，wssv和ihhnv平均单感染率分别为42.6％和38.5％，双病毒共感染率为20.5％[11]。因此ihhnv的鉴别检测在一线养殖场的应用途径广泛。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物。
2、本专利技术的第二个目的在于提供一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的荧光检测试剂盒。
3、本专利技术的第三个目的一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的试纸条。
4、本专利技术的第四个目的在于提供所述基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物、荧光检测试剂盒以及试纸条的应用。
5、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
6、一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物，包括一对rpa引物和crna，其核苷酸序列如下所示：
7、rpa2-f：5＇-gtcatcccgacgacgaagaatggacagaa-3＇(seq id no.1)；
8、rpa2-r：5＇-ttctggtgttgaagttcttggaggagtttga-3＇(seq id no.2)；
9、crrna1：5＇-uaauuucuacuaaguguagauguucgugcguucucgaagca -3＇(seq id no.3)。
10、一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的荧光检测试剂盒，包括上述基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物。
11、所述的试剂盒还包括rpa buffer、nebuffer r2.1、cas 12a蛋白、rna酶抑制剂、ssdna、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
12、所述的ssdna的序列如下：5’-fam-ttatt-bhq1-3’。
13、所述的阳性对照为ihhnv标准阳性质粒。
14、所述的阴性对照为depc水。
15、一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的试纸条，包括上述基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物。
16、所述的试纸条还包括crispr cas12/13hybridetect试纸条、nebuffer r2.1、cas12a蛋白、rna酶抑制剂、ssdna、rpa buffer、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
17、所述的ssdna的序列如下：5’-fam-ttttttt-biotin-3’。
18、所述的基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物、荧光检测试剂盒和试纸条中的至少一种在非疾病诊断治疗目的的检测ihhnv病毒中的应用。
19、一种基于rpa和crispr-cas12a非疾病诊断治疗目的的检测ihhnv病毒的方法，包括如下步骤：
20、(1)提取待测样本的核酸，作为dna模板；
21、(2)rpa扩增
22、配制rpa扩增体系(50μl)：buffer a 29.4μl，10μmol/l上下游引物rpa2-f和rpa2-r各2μl，depc水11.1μl，buffer b 2.5μl，dna模板3μl，于39±1℃条件下进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；其中，上下游引本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于RPA和CRISPR-Cas12a检测IHHNV病毒的引物，其特征在于：包括一对RPA引物和cRNA，其核苷酸序列如下所示：
2.一种基于RPA和CRISPR-Cas12a检测IHHNV病毒的荧光检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的基于RPA和CRISPR-Cas12a检测IHHNV病毒的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA Buffer、NEBuffer r2.1、Cas 12a蛋白、RNA酶抑制剂、ssDNA、阳性对照和阴性对照中的至少一种；
4.一种基于RPA和CRISPR-Cas12a检测IHHNV病毒的试纸条，其特征在于：包括权利要求1所述的基于RPA和CRISPR-Cas12a检测IHHNV病毒的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试纸条还包括CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条、NEBuffer r2.1、Cas 12a蛋白、RNA酶抑制剂、ssDNA、RPA Buffer、阳性对照和阴性对照中的至少一种；
<...【技术特征摘要】
1.一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物，其特征在于：包括一对rpa引物和crna，其核苷酸序列如下所示：
2.一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的荧光检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括rpa buffer、nebuffer r2.1、cas 12a蛋白、rna酶抑制剂、ssdna、阳性对照和阴性对照中的至少一种；
4.一种基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的试纸条，其特征在于：包括权利要求1所述的基于rpa和crispr-cas12a检测ihhnv病毒的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试纸条还包括crispr cas12/13hybridetect试纸条、nebuffer r2.1、cas 12a蛋白、rna酶抑制剂、ssdna、rpa buffer、阳性对照和阴性对照中的至少一种；
6.权...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈轩，周傲白雪，沙才华，邵建宏，黄海超，徐博文，赵福振，蒋晓霞，廖秀云，
申请(专利权)人：拱北海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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