一种定量检测肺炎克雷伯菌的数字LAMP-CRISPR/Cas12b试剂盒制造技术

技术编号：43751938 阅读：2 留言：0更新日期：2024-12-20 13:09

本发明专利技术公开了一种肺炎克雷伯菌定量检测数字LAMP‑CRISPR/Cas12b方法和试剂盒。该方法将LAMP‑CRISPR/Cas12b的特异性与数字芯片技术的绝对定量优势相结合，能够在60分钟内，于恒温条件下对肺炎克雷伯菌进行精确、快速的定量检测，具有高灵敏度和特异性。能够实现对肺炎克雷伯菌DNA的精准定量。痰液中的酸性糖蛋白为Bst聚合酶的抑制因子，本方法使用0.5%盐酸溴己新溶液减少了抑制因子对核酸浓度的负面影响，使数字LAMP‑CRISPR/Cas12b方法对于免核酸提取的热裂解样本的检测灵敏度增加。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测，具体涉及一种基于数字lamp-crispr/cas12b定量检测肺炎克雷伯菌的技术及其相应的检测试剂盒。

技术介绍

1、肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科的革兰氏阴性条件致病菌，是医院获得性感染中能够引起急性呼吸道感染甚至肺炎的最常见细菌病原体之一。2009年至2019年，中国发现肺炎克雷伯菌是急性呼吸道感染患者的三大主要细菌病原体之一，是细菌性肺炎的重要病因。根据carss的数据，近10年来，全球肺炎克雷伯菌在临床分离中的比例从约15%上升至约20%，其相关感染已经成为严重的公共卫生负担。

2、在精准医学的领域中，病原体相关核酸的绝对定量愈发凸显其关键性，量化目标核酸对于确定疾病严重程度和评估治疗效果非常重要。首先，准确定量肺炎克雷伯菌的载量有助于确定疾病严重程度。其次，感染过程中肺炎克雷伯菌载量的动态变化与治疗效果密切相关。因此，精确定量肺炎克雷伯菌有助于临床诊断以及治疗。

3、传统的细菌培养检测方法速度慢，操作复杂，灵敏度低，周转时间长。对于细菌感染的住院患者，不适当的初始抗微生物治疗几乎使30天死亡率风险增加一倍。然而，临床广泛使用的实时荧光pcr（qpcr）方法需要精确的热循环，容易受到抑制物影响，并且当目标病原体的浓度很低时，qpcr的准确性较差。目前临床检测手段无法满足要求。因此，建立一种快速、准确、定量的痰液样品中肺炎克雷伯菌检测方法，将有助于对肺炎克雷伯菌的呼吸道感染进行早期筛查、诊断和治疗，控制肺炎克雷伯菌的传播。

<p>4、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，lamp）技术利用高置换链活性的dna聚合酶在恒温条件下高效特异地扩增靶dna，具有快速、低成本的优势。但lamp技术容易发生引物交叉反应引起的假阳性结果，特异性较低。

5、crispr（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）检测技术是利用cas蛋白反式切割活性，通过向导rna（grna）引导与靶标结合并切割探针发出荧光，实现快速灵敏检测。近年来，基于crispr/cas的生物传感技术已被用于核酸检测。crispr/cas12b比crispr系统中的其他家族成员更具热稳定性，可被lamp扩增产物激活，从而通过非特异性切割报告分子dna产生荧光信号，因此，可以弥补lamp出现假阳性信号的缺点。但尽管具有出色的灵敏度，特异性和便捷性，它仍然无法对核酸进行绝对定量。

6、数字核酸分析技术将核酸检测试剂划分成大量的单个分区，这种区隔化使核酸扩增分析具有量化目标核酸的绝对数量的优势，已被证明可以提高病原体检测的灵敏度和定量准确性。与数字核酸分析技术结合，可以使crispr/cas系统拥有绝对定量的潜力。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，能够实现对痰液样本中肺炎克雷伯菌的绝对定量，提升肺炎克雷伯菌感染早期筛查精准度。利用数字lamp-crispr/cas12b方法对现有肺炎克雷伯菌检测方法进行改进，进而实现肺炎克雷伯菌的灵敏定性和绝对定量，提升肺炎克雷伯菌感染早期筛查精准度。

2、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一组用于检测肺炎克雷伯菌的核酸分子，以及包含上述核酸分子的试剂盒。本专利技术还提供基于lamp-crispr/cas12b与数字芯片技术定量检测肺炎克雷伯菌的方法。

3、所述核酸分子包含用于肺炎克雷伯菌检测的lamp引物组以及grna和ssdna报告分子；

4、所述lamp引物组包含核苷酸序列如seq id no.1-6所示的引物；

5、所述grna靶向肺炎克雷伯菌khe基因的dna片段， dna片段为采用所述lamp引物组扩增得到，其核苷酸序列如seq id no.7所示；

6、所述ssdna报告分子，其核苷酸序列如seq id no.8所示。

7、所述的核酸分子制备的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，，所述试剂盒包含所述的用于肺炎克雷伯菌检测的0.5%盐酸溴己新溶液，warmstart® lamp预混液，lamp引物组，cas12b，grna，ssdna报告分子，rnase抑制剂，mg 2+，depc水和数字芯片。

8、所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的数字芯片为固相分隔芯片，将配置好的lamp-cas12b反应体系加入到刮片的加样孔上；将反应体系从刮片载入到芯片的每个单元中的固相；接着在体系上覆盖一层油相，使每个单元中的反应体系被固相芯片和油相分隔，以形成的数字阵列；将芯片置于60 ℃的水浴中孵育1小时，用生物芯片分析仪检测15000个分区的终点荧光并根据分区的荧光分布确定阈值，并根据阈值计算阳性分区百分比和输入核酸浓度。

9、所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，所述数字芯片为固相分隔芯片，微流控液滴芯片及其他可实现数字化分隔的芯片中的一种或多种。

10、所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，将用于肺炎克雷伯菌检测的0.5%盐酸溴己新溶液，1×warmstart® lamp预混液，1×lamp引物，250nm cas12b，250nm grna，3μm ssdna报告分子，1000u/ml rnase抑制剂，4mm mg 2+和depc水与待测样品混合，形成反应体系，之后于恒温条件下进行lamp-crispr/cas12b反应。

11、所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，所述反应的体系中，核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示的引物的浓度为1 μm ,核苷酸序列如seq id no.5和6所示的引物的浓度为0.1 μm ,核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的引物的浓度为0.2 μm，核苷酸序列如seq id no.7所示的grna的浓度为250 nm，核苷酸序列如seq id no.8所示的ssdna的浓度为3 μm。

12、所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，所述恒温条件为60℃下孵育60 min。

13、第一方面，本专利技术提供用于肺炎克雷伯菌检测的lamp引物组序列，所述序列如seqid no.1-6所示。

14、上述lamp引物组中各引物的核苷酸序列具体如下(5’-3’)：

15、上游外部引物khe-f3(seq id no .1)：

16、acggctatctctggaagct

17、下游外部引物khe-b3(seq i本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一组用于肺炎克雷伯菌检测的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含用于肺炎克雷伯菌检测的LAMP引物组以及gRNA和ssDNA报告分子；

2.根据权利要求1所述的核酸分子制备的肺炎克雷伯菌定量检测数字LAMP-CRISPR/Cas12b试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含所述的用于肺炎克雷伯菌检测的0.5%盐酸溴己新溶液，WarmStart® LAMP预混液，LAMP引物组，Cas12b，gRNA，ssDNA报告分子，RNase抑制剂，Mg 2+，DEPC水和数字芯片。

3.根据权利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字LAMP-CRISPR/Cas12b试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的数字芯片为固相分隔芯片，将配置好的LAMP-Cas12b反应体系加入到刮片的加样孔上；将反应体系从刮片载入到芯片的每个单元中的固相；接着在体系上覆盖一层油相，使每个单元中的反应体系被固相芯片和油相分隔，以形成的数字阵列；将芯片置于60 ℃的水浴中孵育1小时，用生物芯片分析仪检测15000个分区的终点荧光并根据分区的荧光分布确定阈值，并根据阈值计算阳性分区百分比和输入核酸浓度。

4.根据权利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字LAMP-CRISPR/Cas12b试剂盒，其特征在于，所述数字芯片为固相分隔芯片，微流控液滴芯片及其他可实现数字化分隔的芯片中的一种或多种。

5.根据权利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字LAMP-CRISPR/Cas12b试剂盒，其特征在于，将用于肺炎克雷伯菌检测的0.5%盐酸溴己新溶液，1×WarmStart® LAMP预混液，1×LAMP引物，250nM Cas12b，250nM gRNA，3μM ssDNA报告分子，1000U/mL RNase抑制剂，4mM Mg 2+和DEPC水与待测样品混合，形成反应体系，之后于恒温条件下进行LAMP-CRISPR/Cas12b反应。

6.根据权利要求5所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字LAMP-CRISPR/Cas12b试剂盒，其特征在于，所述反应的体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物的浓度为1 μM ,核苷酸序列如SEQ ID NO.5和6所示的引物的浓度为0.1 μM ,核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物的浓度为0.2 μM，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的gRNA的浓度为250 nM，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的ssDNA的浓度为3 μM。

7.根据权利要求6所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字LAMP-CRISPR/Cas12b试剂盒，其特征在于，所述恒温条件为60℃下孵育60 min。

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【技术特征摘要】

1.一组用于肺炎克雷伯菌检测的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含用于肺炎克雷伯菌检测的lamp引物组以及grna和ssdna报告分子；

2.根据权利要求1所述的核酸分子制备的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含所述的用于肺炎克雷伯菌检测的0.5%盐酸溴己新溶液，warmstart® lamp预混液，lamp引物组，cas12b，grna，ssdna报告分子，rnase抑制剂，mg 2+，depc水和数字芯片。

3.根据权利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的数字芯片为固相分隔芯片，将配置好的lamp-cas12b反应体系加入到刮片的加样孔上；将反应体系从刮片载入到芯片的每个单元中的固相；接着在体系上覆盖一层油相，使每个单元中的反应体系被固相芯片和油相分隔，以形成的数字阵列；将芯片置于60 ℃的水浴中孵育1小时，用生物芯片分析仪检测15000个分区的终点荧光并根据分区的荧光分布确定阈值，并根据阈值计算阳性分区百分比和输入核酸浓度。

4.根据权利要求2所述的肺炎克雷伯菌定量检测数字lamp-crispr/cas12b试剂盒，其特征在于，所述数字芯片为固相分隔芯片，微流控液滴芯片及其他可实现数字化...

【专利技术属性】
技术研发人员：季明辉，孙舒婷，周子涵，戴启刚，高畅，庄添驰，孙涛，梅浩坤，李宁，刘云，贾书仪，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人