【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法。
技术介绍
1、
2、细菌耐药性对人类的风险主要体现在：1.是否在人类相关环境中富集；2.耐药菌是否具有高致病性；3.耐药细菌的增殖与传播。虽然已有许多针对沼液施用土壤中细菌耐药性的研究，但大多聚焦于兽用抗生素的耐药性分析，忽视了沼液施用土壤中可能产生的临床药物耐药风险，临床使用的抗生素无疑有更高的保护价值。分离鉴定临床抗生素的耐药菌，分析其是否多重耐药，可预测耐药菌的污染流通过程，对进一步抑制耐药菌的传播具有重要的意义。
3、目前的研究主要使用稀释涂布平板法分离沼液施用土壤中耐药菌，其种类主要为传统抗生素抗性细菌或兽用抗生素抗性细菌，所选抗生素种类与人类重要临床抗生素直接关联较少，无法聚焦沼液施用土壤中的典型高风险耐药菌。同时，鲜有专利将稀释平板法和药敏试验相结合，因此无法分析沼液施用土壤中耐药细菌的多重耐药性及其潜在风险。
4、现有的技术方法主要有以下：
5、1、一种筛选鉴定抗生素抗性菌的方法，为高效批量、筛选鉴定抗生素抗性菌的方法：取土壤样本与磷酸盐缓冲液混合，经稀释后制成不同梯度的土壤悬浮液。在lb培养基中加入抗生素溶液(目标抗生素为红霉素、链霉素、硫酸多粘菌素b兽用药物)，倒平板后将土壤悬浮液涂布于平板上，培养观察并确定最佳稀释梯度。在最佳梯度批量平板涂布，培养后用移液枪灭菌枪头挑取菌落，震荡培养并使用甘油保藏。菌株使用高通量测序鉴定。
6、2.wang y,sutton n b,zh
7、3.pu chengjun p c j,liu hang l h,ding guochun d g c,et al.impact ofdirect application of biogas slurry and residue in fields:in situ analysis ofantibiotic resistance genes from pig manure to fields[j].2018.告知了如下方法：采集了施用10年沼液的土壤样品及相似土壤类型的未施加沼液土壤作为对照，将土壤样品溶于生理盐水中制成土壤悬浮液，梯度稀释后涂布于选择性培养基上(目标抗生素为磺胺甲氧基吡啶(sul)；四环素(tet)、诺氟沙星(nor)、红霉素(ery)、万古霉素(van)；头孢噻肟(ctx)、链霉素(str)类兽用药物)，倒置培养后计数菌落数量，对比得出施加沼液是否诱导了耐药细菌的富集。
8、上述现有技术存在缺点为：
9、1.选取的抗生素多为传统抗生素和兽用抗生素，忽视了沼液施用土壤中耐药细菌对重要临床抗生素的抗性。
10、2.无法鉴别菌株的多重耐药性，对细菌的耐药风险分析不全面。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法。
2、说明：临床重要抗生素的选择和多重耐药性都是耐药性的体现。因此，高风险耐药细菌包括对重要抗生素产生耐药性(包括多重耐药性)的耐药细菌。
3、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，包括以下步骤：
4、1)、设定待检测的抗生素：
5、包括头孢菌素类、喹诺酮类、碳青霉烯类、糖肽类抗生素；
6、2)、耐药菌的筛选，包括以下步骤：
7、2.1)、制备梯度浓度的土壤悬浮液；
8、所述土壤包括长期施用沼液的待测土壤样品及与待测土壤样品相似地理位置和土壤性质的对照土壤样品；
9、2.2)、向r2a营养培养基中加入设定浓度的抗生素以及放线菌酮，制成选择性培养基；
10、说明：向r2a营养培养基中加入设定浓度的抗生素，该设定浓度为美国临床和实验室标准协会clsi设定的菌种所能承受的最大量，以保证培养出的菌种都有极强的耐药性；
11、2.3)、将土壤悬浮液均匀涂布于该抗生素相应的梯度浓度的选择性培养基，倒置培养(可为7℃恒温培养)，从而确定该抗生素最佳的稀释梯度；当平板内菌落数不多于200个时的最大梯度，判定为最佳稀释梯度；
12、2.4)、将不同稀释梯度的长期施用沼液的待测土壤样品在该抗生素对应的选择培养基上培养2天后，选取最佳稀释梯度的土壤悬浮液，在对应抗生素的选择性培养基上批量涂布平板并倒置培养并挑取长势较好的独立菌落；
13、同理，将不同稀释梯度的长期施用沼液的待测土壤样品在该抗生素对应的选择培养基上培养2天后，选取最佳稀释梯度的土壤悬浮液，在对应抗生素的选择性培养基上批量涂布平板并倒置培养；
14、针对相同的抗生素对应的最佳梯度选择培养基，通过计数对比沼液施用土样与对照土样的平板上长出的菌落数，实现耐药细菌的筛选(即，得出可培养的相关抗生素抗性细菌的富集情况)。
15、作为本专利技术的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法的改进，还包括如下的步骤3)：
16、针对获得的耐药细菌，进行药敏试验，从而鉴别具有多重耐药性的菌株。
17、作为本专利技术的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法的进一步改进：
18、所述头孢菌素类抗生素包括头孢呋辛、头孢哌酮；
19、所述喹诺酮类抗生素包括莫西沙星、左氧氟沙星；
20、所述碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南；
21、所述糖肽类抗生素包括万古霉素(盐酸万古霉素)、多粘菌素b。
22、作为本专利技术的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法的进一步改进：
23、所述步骤2.1)为：
24、取土壤样品与胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb)按照1g土样与9mltsb培养基比例混合，用于激活土样中的菌群，震荡后用移液枪吸取上清液用灭菌去离子水进行梯度稀释，制成不同梯度的土壤悬浮液(梯度稀释便于计数)；
25、不同梯度的土壤悬浮液，具体为：
26、9ml tsb溶液与1g土壤样品混合制成×10倍tsb供体，1ml×10倍tsb供体与9ml去离子水混合制得×100倍tsb供体；1ml×100倍tsb供体与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于还包括如下的步骤3)：
3.根据权利要求1或2所述的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于：
6.根据权利要求2～5任一所述的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于：药敏试验鉴别菌株多重耐药性具体为：
【技术特征摘要】
1.一种沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于还包括如下的步骤3)：
3.根据权利要求1或2所述的沼液施用土壤中高风险耐药细菌的筛选方法，其特征在于：
4....
【专利技术属性】
技术研发人员：李纪伟，鲁祎，靳泽文，平立凤，单胜道，
申请(专利权)人：浙江科技大学，
类型：发明
国别省市：
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