【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及引物检测领域，特别涉及一种柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合、试剂盒及应用。
技术介绍
1、手足口病(hand-foot-mouth disease,hfmd)是由多种肠道病毒(enterovirus,ev)感染引起的常见传染病，主要病原包括柯萨奇病毒a组(coxsackievirus a,ca)4—7、9、10、16型和b组1—3、5型，埃可病毒的部分血清型和ev71等。手足口病多发于0-5岁婴幼儿，典型表现为发热，手、足、臀、口腔等部位的斑丘疹、疱疹，目前cva6已超过ev71和cva16成为hfmd的主要病原体，柯萨奇病毒a6引起的手足口病，该型皮损更广泛、更严重，水疱大疱性皮损可累及手背、足背、小腿、前臂、躯干及颈部、口周，严重症状导致可能危及生命的脑炎及肺出血等并发症。
2、cva6属小核糖核酸病毒科肠道病毒属a组，呈二十面体球型，无包膜，为单股正链rna，基因组全长约7 400bp，包含1个开放阅读框及5′和3′非编码区。cva6具有ev的一般理化特性，耐低温耐酸，但可在高于56℃的温度下失去活性，对干燥、紫外线和氧化剂较敏感。cva6毒株可分为6种基因型，分别为a至f，d基因型可进一步细分为d1-3亚型。
3、目前针对于cva6的研究和鉴定主要有以下几种方法：1.传统血清学方法：采集患者血液样本，分离血清后使用特异性抗原进行检测，然而这种方法耗时久，且病毒分离有失败的可能，灵敏度不够；2.常规定量pcr方法：根据cva6核酸序列特点设计引物和探针，在特定的反应体系和反应条件下，通
4、综上所述，目前市面上暂无针对于柯萨奇a6的全基因组的研究，导致无法很好地理解病毒的遗传变异、进化关系，以及无法很好地针对该病毒进行有效防控措施。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合、试剂盒及应用，针对柯萨奇a6亚型的全基因组按照叠瓦式原理设计了7对引物的引物池，利用引物池实现cva6亚型全基因组产物的反转录与富集扩增。
2、为实现以上目的，本技术方案提供了一种柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合，包括：
3、第一引物池，其中第一引物池包括序列如seq id no.1-seq id no.3的第一引物对、序列如seq id no.6-seq id no.7的第三引物对、序列如seq id no.10-seq id no.11的第五引物对、序列如seq id no.14-seq id no.16的第七引物对；
4、第二引物池，其中所述第二引物池包括序列如seq id no.4-seq id no.5的第二引物对、序列如seq id no.8-seq id no.9的第四引物对、序列如seq id no.12-seq idno.13的第六引物对；
5、第一引物池和第二引物池内的引物对的引物序列依次交叉重叠。
6、本方案提供的柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合针对cva6亚型的全基因组按照叠瓦式原理设计了7对引物对，相邻引物对之间存在重叠的重叠序列，进而避免了在扩增过程中缺失全基因组中的部分片段。不仅如此，本方案将7对引物对中相邻的具有重叠序列的引物对分为两个引物池，利用两个引物池对cva6亚型进行全基因组分段扩增，避免优先扩增相对较短的重叠序列，最后把扩增产物混合就得到了cva6亚型全基因组产物，实现cva6亚型全基因组反转录与富集扩增，最终得到的dna产物可用于各种分子生物学实验，包括二代和三代全基因组测序实验。
7、在一些实施例中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对和第七引物对通过叠瓦式pcr原理设计得到。本方案的第一引物池和第二引物池内的引物对的引物序列依次交叉重叠指的是：第二引物池内的偶数值对应的引物对同第一引物池内的相邻的奇数值对应的引物对具有重叠序列。
8、具体的：
9、第二引物池内的第二引物对同第一引物池的第一引物对以及第三引物对分别具有重叠序列；
10、第二引物池内的第四引物对同第一引物池的第三引物对以及第五引物对分别具有重叠序列；
11、第二引物池内的第六引物对同第一引物池内的第五引物对以及第七引物对分别具有重叠序列。
12、另外，第一引物池内的不同引物对彼此之间不具有重叠序列，第二引物池内的不同引物对之间也不具有重叠序列。
13、在一些实施例中，第一引物对包括seq id no.1所示的左引物、seq id no.2的左引物和seq id no.3所示的右引物，第二引物对包括seq id no.4所示的左引物和seq idno.5所示的右引物，第三引物对包括seq id no.6所示的左引物和seq id no.7所示的右引物，第四引物对包括seq id no.8所示的左引物和seq id no.9所示的右引物，第五引物对包括seq id no.10所示的左引物和seq id no.11所示的右引物，第六引物对包括seq idno.12所示的左引物和seq id no.13所示的右引物，第七引物对包括seq id no.14所示的左引物、seq id no.15所示的右引物和seq id no.16所示的右引物。同一引物对内的左引物将结合到目标dna的正链上，并从5'端向3'端延伸，相对的右引物将结合到结合到目标dna的负链上，并同样从5'端向3'端延伸，进而实现特异性地扩增复制。关于第一引物池和第二引物池的引物序列如表一所示：
14、表一引物序列表
15、
16、
17、
18、在一些实施例中，第一引物池和第二引物池内的每一引物对的扩增片段在1024-1200bp，优选在1200bp的长度，确保扩增产物的高效性与保真性；且每一引物对选择在保守性较高的区域。
19、具体的，第一引物对覆盖1-1294bp的位置，第二引物对覆盖1102-2381bp的位置，第三引物对覆盖2159-3330bp的位置，第四引物对覆盖3190-4469bp的位置，第五引物对覆盖4218-5505bp的位置，第六引物对覆盖5369-6572bp的位置，第七引物对覆盖6390-7414bp的位置。
20、在一些实施例中，同时在第一引物对中添加了一条正向引物，第七引物对中添加了一条反向引物。这样做的好处在于有很多病毒的参考基因组的首尾是不全的，设计引物的时候只有很少的序列可以参考，引物设计本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种柯萨奇A6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的柯萨奇A6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第二引物池内的偶数值对应的引物对同第一引物池内的相邻的奇数值对应的引物对具有重叠序列。
3.根据权利要求1所述的柯萨奇A6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第二引物池内的第二引物对同第一引物池的第一引物对以及第三引物对分别具有重叠序列，第二引物池内的第四引物对同第一引物池的第三引物对以及第五引物对分别具有重叠序列，第二引物池内的第六引物对同第一引物池内的第五引物对以及第七引物对分别具有重叠序列。
4.根据权利要求1所述的柯萨奇A6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第一引物池内的不同引物对彼此之间不具有重叠序列，第二引物池内的不同引物对之间也不具有重叠序列。
5.根据权利要求1所述的柯萨奇A6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第一引物池和第二引物池内的每一引物对的扩增片段在1024-1200bp。
6.一种柯萨奇A6的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1到5任一所述的柯萨奇A
7.根据权利要求6所述的柯萨奇A6的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，用于扩增柯萨奇A6全基因组产物。
8.根据权利要求6所述的柯萨奇A6的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，面向于鼻咽拭子、肛拭子、疱疹液环境中提取的核酸样本进行柯萨奇A6全基因组产物的捕获。
9.一种柯萨奇A6的全基因组捕获的非诊断方法，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的柯萨奇A6的全基因组捕获的非诊断方法，其特征在于，多重PCR扩增的条件相同，多重PCR扩增条件为：循环1：在98℃进行30秒；循环2：在98℃进行15秒并在63℃下进行5分钟；循环3：在98℃进行15秒并在65℃下进行4分钟；循环4：在72℃进行2分钟；循环5：在4℃保持，其中循环2进行5个循环，循环3进行25个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第二引物池内的偶数值对应的引物对同第一引物池内的相邻的奇数值对应的引物对具有重叠序列。
3.根据权利要求1所述的柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第二引物池内的第二引物对同第一引物池的第一引物对以及第三引物对分别具有重叠序列，第二引物池内的第四引物对同第一引物池的第三引物对以及第五引物对分别具有重叠序列，第二引物池内的第六引物对同第一引物池内的第五引物对以及第七引物对分别具有重叠序列。
4.根据权利要求1所述的柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第一引物池内的不同引物对彼此之间不具有重叠序列，第二引物池内的不同引物对之间也不具有重叠序列。
5.根据权利要求1所述的柯萨奇a6的全基因组捕获引物组合，其特征在于，第一引物池和第二引物池内的每一引物对的扩增片段在1024-...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，周显凤，贺凤兰，毛凌峰，涂俊凌，唐旖，王磊，
申请(专利权)人：杭州柏熠科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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