【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段及其应用。
技术介绍
1、claudin是一类由多基因家族编码的四次跨膜蛋白，是形成细胞间紧密连接结构的重要成分。claudin18是该家族成员之一，其编码基因经可变剪接可形成两种亚型蛋白claudin18.1和claudin18.2。claudin18.1在正常和癌性肺组织中特异性表达，claudin18.2不表达在除胃粘膜以外的任何健康组织中，但在胃癌中广泛表达，尤其是劳伦分型中的弥漫型。claudin18.2蛋白的n端和c端都位于细胞内，整个蛋白表达于细胞膜上，是细胞紧密连接的重要结构成分。
2、claudin18.2的临床上的用途有多种：
3、1、是特异性单克隆抗体药zolbetuximab伴随诊断的靶点。
4、2、和cadherin-17联用可以作为胃癌细胞检测和定位的有效手段。
5、3、与胰腺癌、食道癌、和非小细胞肺癌治疗相关。
6、液态细胞作为质控品应用于免疫组化染色，以消除实验过程中的实验误差。但自然界中缺乏高表达claudin18.2的细胞，没有天然细胞可作为质控品，故需应用基因改造技术构建高表达claudin18.2的细胞，作为液态细胞质控品的阳性对照。同时，claudin18.2作为胃癌检测、诊断、治疗热门靶点，其过表达细胞株可作为诊断、治疗研发中的材料。
7、由于claudin18.2为四次跨膜蛋白，受细胞表面积限制，其多次跨膜蛋白的表达量受到限制。同时，不像核定位信号（
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的一种，本专利技术提供了一种将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段及其应用，可实现高效快速地将蛋白/多肽定位于细胞膜表面，无需合成蛋白全长，缩减基因合成成本。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术手段：
3、本专利技术的第一方面提供了一种将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段，包括claudin18.2 1-27aa序列，pdgfr膜定位序列，多克隆位点以及编码目的蛋白的基因，多克隆位点位于claudin18.2 1-27aa序列和pdgfr膜定位序列之间，编码目的蛋白的基因插入到多克隆位点中，所述claudin18.2 1-27aa序列的核苷酸序列如seq id no .6所示。
4、在本专利技术的一些实施方案中，所述编码目的蛋白的基因包括claudin18.2蛋白基因及muc-4蛋白基因。
5、在本专利技术的一些实施方案中，所述载体片段的两端分别加入酶切位点ecori及bamhi序列。载体片段序列的两端分别加入酶切位点ecori及bamhi序列，为克隆到慢病毒载体中提供酶切位点。
6、本专利技术的第二方面提供了一种编码第一方面述载体片段的基因，编码将claudin18.2蛋白定位于细胞膜表面的载体片段的基因的核苷酸序列如seq id no .4，编码将muc-4蛋白定位于细胞膜表面的载体片段的基因的核苷酸序列如seq id no .5所示。
7、本专利技术的第三方面提供了一种慢病毒载体，包含第二方面所述的基因。在本专利技术的一些实施方案中，将合成的载体片段的基因根据酶切位点ecori及bamhi克隆到plv-cmv-mcs-ef1α-puro质粒中。
8、在一些实施方案中，还包括将质粒转化至大肠杆菌dh5α进行扩大培养的步骤。
9、本专利技术的第四方面提供了一种稳定表达目的蛋白的细胞池，所述细胞池的构建方式为慢病毒方式、脂质体转染方式或者细胞电转化方式中的一种。
10、本专利技术的第五方面提供了第一方面所述的载体片段在作为将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面的载体工具中的应用。
11、本专利技术的第六方面提供了一种第一方面所述的载体片段作为将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面的载体工具在肿瘤药物研究中的应用。
12、本专利技术的第七方面提供了一种第一方面所述的载体片段作为将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面的载体工具在制备用于免疫检测质控品的工程细胞株中的应用。在本专利技术的一些实施方案中，免疫检测质控品为液态质控品。在本专利技术的一些实施方案中，所述液态质控品用于细胞或组织的各种免疫检测，包括但不限于免疫组化、免疫荧光、蛋白免疫印迹。
13、本专利技术的第八方面提供了一种将目的蛋白定位于细胞膜表面的方法，采用第一方面所述的载体片段作为细胞膜定位信号分子，将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面。
14、本专利技术的有益效果
15、相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：多次跨膜蛋白受细胞表面积限制，无法达到高表达，如claudin18.2；个别膜蛋白虽为单次跨膜蛋白，但分子量巨大，做过表达基因合成成本高，如muc-4。本专利技术提供了一种可将过表达的目的蛋白定位于细胞膜上的载体片段，包括claudin18.2 1-27aa序列，pdgfr膜定位序列，多克隆位点以及编码目的蛋白的基因，多克隆位点位于claudin18.2 1-27aa序列和pdgfr膜定位序列之间，编码目的蛋白的基因插入到多克隆位点中。该结构分子可高效快速地将目的蛋白片段定位于细胞膜表面，并且位于细胞膜外，实现包膜定位蛋白高表达，同时，也不需要合成蛋白全长，缩减基因合成成本；经claudin18.2蛋白以及muc-4蛋白验证，均可用于细胞池的构建，还可用于液态细胞质控品，其应用包括但不限于细胞免疫组化、蛋白免疫印迹。
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1.将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段，其特征在于：包括Claudin18.2 1-27aa序列，PDGFR膜定位序列，多克隆位点以及编码目的蛋白的基因，多克隆位点位于Claudin18.2 1-27aa序列和PDGFR膜定位序列之间，编码目的蛋白的基因插入到多克隆位点中，所述Claudin18.2 1-27aa序列的核苷酸序列如SEQ ID No .6所示。
2.根据权利要求1所述的将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段，其特征在于：所述编码目的蛋白的基因包括Claudin18.2蛋白基因及MUC-4蛋白基因。
3.根据权利要求2所述的将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段，其特征在于：所述载体片段的两端分别加入酶切位点EcoRI及BamHI序列。
4.编码权利要求2所述载体片段的基因，其特征在于：编码将Claudin18.2蛋白定位于细胞膜表面的载体片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No .4，编码将MUC-4蛋白定位于细胞膜表面的载体片段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No .5所示。
5.一种稳定表达目的蛋白的细胞池，其
6.根据权利要求5所述的一种稳定表达目的蛋白的细胞池，其特征在于：所述细胞池的构建方式为慢病毒方式、脂质体转染方式或者细胞电转化方式中的一种。
7.一种权利要求1所述的载体片段在作为将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面的载体工具中的应用。
8.一种权利要求1所述的载体片段作为将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面的载体工具在肿瘤药物研究中的应用。
9.一种权利要求1所述的载体片段作为将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面的载体工具在制备用于免疫检测质控品的工程细胞株中的应用。
10.一种将目的蛋白定位于细胞膜表面的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的载体片段作为细胞膜定位信号分子，将过表达的目的蛋白定位于细胞膜表面。
...【技术特征摘要】
1.将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段，其特征在于：包括claudin18.2 1-27aa序列，pdgfr膜定位序列，多克隆位点以及编码目的蛋白的基因，多克隆位点位于claudin18.2 1-27aa序列和pdgfr膜定位序列之间，编码目的蛋白的基因插入到多克隆位点中，所述claudin18.2 1-27aa序列的核苷酸序列如seq id no .6所示。
2.根据权利要求1所述的将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段，其特征在于：所述编码目的蛋白的基因包括claudin18.2蛋白基因及muc-4蛋白基因。
3.根据权利要求2所述的将目的蛋白定位于细胞膜表面的载体片段，其特征在于：所述载体片段的两端分别加入酶切位点ecori及bamhi序列。
4.编码权利要求2所述载体片段的基因，其特征在于：编码将claudin18.2蛋白定位于细胞膜表面的载体片段的基因的核苷酸序列如seq id no .4，编码将m...
【专利技术属性】
技术研发人员：党南卯，王雅萍，张玲，李明振，蔡宁，
申请(专利权)人：杭州百凌生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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