【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种细菌细胞破碎制剂及方法。
技术介绍
1、大肠杆菌为目前最广泛使用的原核表达宿主，大肠杆菌的表达外源蛋白时一般存在于胞内或周质空间中，要获得重组蛋白首先要进行细胞破碎。通常比较有效的破碎方法有高压匀浆、珠磨法和超声波破碎等物理方法。但这些属于较为剧烈的破碎方法，破碎过程中产生的剪切力与温度上升存在使目标产物变性的风险，且能耗较大，需要特殊机械设备。化学渗透法、冻融法等其他方法对大肠杆菌的破碎效率很低。
2、以各种溶菌酶为基础的大肠杆菌酶法破碎方法目前有2种：(1)直接使用溶菌酶对大肠杆菌裂解，条件温和，能有效降低蛋白变性，但是溶菌酶价格较高，破碎成本高；(2)在需要裂解的大肠杆菌中表达溶菌酶，将重组蛋白和溶菌酶在大肠杆菌中同时表达，然后经过冻融或表面活性剂、低浓度有机溶剂如氯仿等方法处理后，将细胞裂解，释放胞内蛋白；此法不需要直接添加溶菌酶，成本低，温和，破碎效率高，但溶菌酶和重组蛋白同时在大肠杆菌中表达，溶菌酶的表达会干扰重组蛋白的表达；大肠杆菌生长过程中溶菌酶有微量泄露，会降低大肠杆菌的生长速度，影响大肠杆菌的生长与重组蛋白的表达。
3、因此，目前需研究开发一种成本低，温和，不会影响大肠杆菌的生长与重组蛋白的表达的高效的大肠杆菌破碎方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种细菌细胞破碎制剂及方法。该方法对细菌细胞破碎简单高效，条件温和，且成本较低。
2、本专利技术原理是将溶菌酶在大肠杆菌细胞内表达，由
3、为此，本专利技术第一方面提供了一种细菌细胞破碎制剂，其包含作为细菌细胞破碎主剂的表达溶菌酶的大肠杆菌菌体和/或表达溶菌酶的大肠杆菌菌体制得的溶菌酶粗品，其中，所述溶菌酶为能够水解肽聚糖的酶。
4、在本专利技术的一些实施例中，所述溶菌酶包括t4溶菌酶、t7溶菌酶和λ溶菌酶中的一种或几种。
5、根据本专利技术，所述细胞破碎制剂还包含细胞破碎助剂，其包括细胞破碎液降粘制剂、表面活性剂、金属络合剂、tris缓冲液和有机溶剂中的一种或几种。
6、在本专利技术的一些实施例中，所述细胞破碎液降粘制剂包括非特异水解dna的核酸酶、表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体、由表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体制得的核酸酶粗品中的一种或几种。
7、本专利技术第二方面提供了一种细胞破碎方法，其采用如本专利技术第一方面所述的细胞破碎制剂对待破碎菌进行细胞破碎。
8、本专利技术中，所述待破碎菌包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
9、根据本专利技术，所述细胞破碎方法包括将待破碎菌菌悬液与细胞破碎制剂混合形成细胞破碎体系，然后进行细胞破碎处理，使得待破碎菌细胞裂解。
10、根据本专利技术，在所述细胞破碎体系中，所述待破碎菌菌悬液与表达溶菌酶的大肠杆菌菌悬液混合形成混合菌悬液。
11、在本专利技术的一些实施例中，在混合菌悬液中，表达溶菌酶的大肠杆菌菌悬液的浓度与待破碎菌菌浓度之比≥1:5000。
12、本专利技术中，所述细胞破碎制剂包含作为细菌细胞破碎主剂的表达溶菌酶的大肠杆菌菌体和/或表达溶菌酶的大肠杆菌菌体制得的溶菌酶粗品，其中，所述溶菌酶为能够水解肽聚糖的酶。
13、在本专利技术的一些实施例中，所述溶菌酶包括但不限于t4溶菌酶、t7溶菌酶和λ溶菌酶中的一种或几种。
14、根据本专利技术，所述细胞破碎制剂还包含细胞破碎助剂，其包括细胞破碎液降粘制剂、表面活性剂、金属络合剂、tris缓冲液和有机溶剂中的一种或几种。
15、本专利技术中，所述表面活性剂包括但不限于烷基糖苷apg0814、烷基糖苷apg0810和triton x-100的一种或几种；优选地，本专利技术中所述表面活性剂的工作浓度包括但不限于0-5％(w/v)。
16、本专利技术中，所述金属络合剂包括但不限于edta等；优选地，所述金属络合剂的工作浓度包括但不限于0-30mm。
17、本专利技术中，所述有机溶剂包括但不限于甲苯和/或氯仿等；优选地，所述有机溶剂的工作浓度包括但不限于0-2％(v/v)。
18、优选地，所述tris缓冲液的浓度包括但不限于0-100mm。
19、如前所述，本专利技术原理是将溶菌酶在大肠杆菌细胞内表达，由于细胞质中的溶菌酶不接触细胞膜外的细胞壁，它不会对细菌的生长产生的非常极端的不利影响。
20、在本专利技术的一些具体的例子中，采用表达溶菌酶的大肠杆菌对待破碎菌进行破碎，将待破碎菌菌悬液与表达溶菌酶的大肠杆菌菌悬液混合形成混合菌悬液，向其中加入表面活性剂、金属络合剂、tris缓冲液、有机溶剂等中的一种或几种细胞破碎助剂，在细胞破碎助剂的作用下，含溶菌酶的细胞内的溶菌酶会释放出，从而对不含溶菌酶的待破碎大肠杆菌细菌壁进行水解，共同作用导致待破碎大肠杆菌细胞破碎。
21、在一些具体例子中，所述表达溶菌酶的大肠杆菌包括但不限于根据大肠杆菌密码子优化设计含有t4溶菌酶目的序列的dna序列(如seq id no.1所示)的大肠杆菌、根据大肠杆菌密码子优化设计含有t7溶菌酶目的序列的dna序列(如seq id no.3所示)的大肠杆菌。
22、在一些具体例子中，所述细胞破碎助剂还包括细胞破碎液降粘制剂，其能够在细胞破碎过程中降低细胞破碎液的粘度，有益于细胞破碎，有利于破碎液处理。
23、本专利技术中，所述细胞破碎液降粘制剂包括非特异水解dna的核酸酶、表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体、由表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体制得的核酸酶粗品中的一种或几种。
24、优选地，细胞破碎液降粘制剂包括表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体和/或由表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体制得的核酸酶粗品。
25、优选地，所述非特异水解dna的核酸酶包括全能核酸酶、金黄色葡萄球菌核酸酶b(staphylococcus aureus nucleaseb)和脱氧核糖核酸酶i中的一种或几种。
26、进一步优选地，在细胞破碎体系中，降粘制剂的浓度与含待破碎菌的菌悬液中菌浓度之比≥1:20万。
27、在一些具体例子中，所述表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌包括但不限于根据大肠杆菌密码子优化设计含有粘质沙雷菌(serratia marcescens)来源的全能核酸酶目的序列的dna序列(如seq id no.2所示)的大肠杆菌。
28、在本专利技术的一些实施例中，在所述细胞破碎体系中，所述细胞破碎制剂中细胞破碎主剂、细胞破碎助剂同时加入或者分次加入。...
【技术保护点】
1.一种细菌细胞破碎制剂，其包含作为细菌细胞破碎主剂的表达溶菌酶的大肠杆菌菌体和/或表达溶菌酶的大肠杆菌菌体制得的溶菌酶粗品，其中，所述溶菌酶为能够水解肽聚糖的酶。
2.根据权利要求1所述的细菌细胞破碎制剂，其特征在于，所述溶菌酶包括T4溶菌酶、T7溶菌酶和λ溶菌酶中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的细胞破碎制剂，其特征在于，所述细菌细胞破碎制剂还包含细胞破碎助剂，其包括细胞破碎液降粘制剂、表面活性剂、金属络合剂、tris缓冲液和有机溶剂中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的细胞破碎制剂，其特征在于，所述细胞破碎液降粘制剂包括非特异水解DNA的核酸酶、表达非特异水解DNA的核酸酶的大肠杆菌菌体、由表达非特异水解DNA的核酸酶的大肠杆菌菌体制得的核酸酶粗品中的一种或几种。
5.一种细胞破碎方法，其采用如权利要求1-4中任意一项所述的细胞破碎制剂对待破碎菌进行细胞破碎。
6.根据权利要求5所述的细胞破碎方法，其特征在于，所述细胞破碎方法包括将待破碎菌菌悬液与细胞破碎制剂混合形成细胞破碎体系，然后进行细胞破碎处理
7.根据权利要求6所述的细胞破碎方法，其特征在于，在所述细胞破碎体系中，所述细胞破碎制剂中细胞破碎主剂、细胞破碎助剂同时加入或者分次加入。
8.根据权利要求7所述的细胞破碎方法，其特征在于，在所述细胞破碎体系中，所述待破碎菌菌悬液与表达溶菌酶的大肠杆菌菌悬液混合形成混合菌悬液；优选地，在混合菌悬液中，表达溶菌酶的大肠杆菌菌悬液的浓度与待破碎菌菌浓度之比≥1:5000。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的细胞破碎方法，其特征在于，通过冷冻进行细胞破碎处理。
10.根据权利要求5-9中任意一项所述的细胞破碎方法，其特征在于，所述待破碎菌包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
...【技术特征摘要】
1.一种细菌细胞破碎制剂，其包含作为细菌细胞破碎主剂的表达溶菌酶的大肠杆菌菌体和/或表达溶菌酶的大肠杆菌菌体制得的溶菌酶粗品，其中，所述溶菌酶为能够水解肽聚糖的酶。
2.根据权利要求1所述的细菌细胞破碎制剂，其特征在于，所述溶菌酶包括t4溶菌酶、t7溶菌酶和λ溶菌酶中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的细胞破碎制剂，其特征在于，所述细菌细胞破碎制剂还包含细胞破碎助剂，其包括细胞破碎液降粘制剂、表面活性剂、金属络合剂、tris缓冲液和有机溶剂中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的细胞破碎制剂，其特征在于，所述细胞破碎液降粘制剂包括非特异水解dna的核酸酶、表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体、由表达非特异水解dna的核酸酶的大肠杆菌菌体制得的核酸酶粗品中的一种或几种。
5.一种细胞破碎方法，其采用如权利要求1-4中任意一项所述的细胞破碎制剂对待破碎菌...
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