【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及人ugt1a4基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
1、拉莫三嗪(lamotrigine，ltg)是一种用于治疗癫痫和双相情感障碍的抗惊厥药物。常见的副作用包括嗜睡，头痛，呕吐，协调困难和皮疹。严重的副作用包括缺乏红细胞，导致stevens-johnson综合征和过敏反应。中国癫痫诊疗指南、《拉莫三嗪个体化给药临床药师指引》已列出拉莫三嗪治疗癫痫的参考浓度范围和预警值，以及治疗双相情感障碍的预警值，作为剂量调整和预判不良反应的参考。
2、拉莫三嗪ltg主要在肝微粒体经尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(ugt)代谢，其中主要的代谢酶为ugt1a4,参与多种内源性物质和外源性物质的代谢。多项ugt1a4*3基因多态性与拉莫三嗪药动力学相关的研究，表明ugt1a4*3(142t>g)突变可降低拉莫三嗪血药浓度。
3、针对ugt1a4*3(142t>g)基因多态性检测的方法有多种，主要包含dna直接测序法、核酸质谱分析法、多重pcr结合片段长短分析法。sanger测序法操作复杂,成本较高。cn110184345a和cn113249460a均采用核酸质谱分析方法，专利技术提供了一种用于精神疾病或焦虑症患者用药指导的基因群检测试剂盒pannel，cn109825574a采用多重pcr结合片段长短分析法，公开了一种用于抗癫痫治疗药物用药指导的多重基因检测试剂盒；其中均包含ugt1a4*3多态性位点的设计信息，但是此类设计复杂、包含检测药物很多、检测费用相对很高，更适
4、taqman探针是一种双标记、自淬灭的水解探针，在pcr反应中加入两条两端带有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因。其5’和3’末端分别标记荧光基团和淬灭基团，在探针结构完整时两者距离较近，荧光基团的信号可被淬灭。在pcr扩增过程中，若taqman探针与靶标序列完全匹配，探针则可结合在dna模板上，此时taq酶延伸至探针位置时，其外切酶活性将切割水解探针，释放荧光基团，使得荧光信号增强。而且，随着扩增产物的增多，荧光信号越来越强，从而可通过仪器实时监测荧光信号的变化过程。目前市面上暂没有针对单个位点ugt1a4*3基因多态性的taqman试剂盒，那么开发一种检测ugt1a4*3基因多态性的产品，以实现高灵敏度高特异性、快速且低成本、更方便快捷的ugt1a4*3基因多态性检测是非常必要的。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种采用pcr荧光探针法(改良版)检测人ugt1a4*3基因多态性的试剂盒及其制备方法和应用。该试剂盒能够精确区分ugt1a4*3位点的三种基因型，显著提升了检测的准确性，并降低了最低检出限。这一改进使得该试剂在基因分型检测中的应用更加可靠和高效。用药前通过基因检测结合患者临床及诊断信息，有助于医生快速确定给药方案和药物剂量，减少患者前期试药和剂量调整等过程。
3、(二)技术方案
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
5、本专利技术在一方面，提供了一种用于检测人ugt1a4*3基因多态性的引物和探针组合物，用于检测ugt1a4142t>g位点。包含正向引物f、反向引物r、野生型检测探针和突变型检测探针。还包含内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
6、在一个方面，本专利技术提供了正向引物f、反向引物r、野生型检测探针和突变型检测探针的具体序列：正向引物f选自seq id no:1-3所示的核苷酸序列；反向引物r选自seq idno:4-6所示的核苷酸序列；野生型检测探针选自seq id no:7-8所示的核苷酸序列；突变型检测探针选自seq id no:9-10所示的核苷酸序列。
7、在一个方面，本专利技术提供了内标上游引物、内标下游引物和内标探针的具体序列：内标上游引物为seq id no:11所示的核苷酸序列；内标下游引物为seq id no:12所示的核苷酸序列；内标探针为seq id no:13所示的核苷酸序列。
8、在一个方面，所有检测探针5’端均连接发光报告基团，发光报告基因选自rox、fam或vic；所有检测探针3’端均连接磷酸基团和能够吸收5’端发射荧光信号的淬灭基团，淬灭基团选自bhq2或nfq。
9、在一个方面，本专利技术提供了一种扩增pcr反应溶液，pcr反应溶液包含引物、探针、dntp、tris-hcl、抗体修饰taqdna聚合酶、mgcl2、dutp、37℃非热敏udg酶、kcl、glycerol、dmso、formamide、triton100等组成成分。
10、在一个方面，本专利技术提供了一种人ugt1a4*3基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：样本裂解液、正向引物、反向引物、野生型检测探针、突变型检测探针、内标上游引物、内标下游引物、内标探针、2*pcr反应液、阳性对照和阴性对照。
11、在一个方面，本专利技术提供了一种人ugt1a4*3基因多态性的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将样本裂解液、正向引物、反向引物、野生型检测探针、突变型检测探针、内标上游引物、内标下游引物、内标探针、2*pcr反应液、阳性对照和阴性对照分装到合适的容器中。
12、在一个方面，本专利技术提供一种用于检测人ugt1a4*3基因多态性的引物和探针组合物、pcr反应液和试剂盒的应用，所述应用为在制备检测基因多态性的检测试剂或在制备拉莫三嗪用药指导的试剂中的应用。
13、在一个实施例中，正向引物f优选seq id no:2所示的核苷酸序列，反向引物r优选seq id no:6所示的核苷酸序列，野生型检测探针优选seq id no:7所示的核苷酸序列，突变型检测探针优选seq id no:9所示的核苷酸序列。
14、在一个实施例中，内标探针的5’端连接荧光基团rox，野生型检测探针的5’端连接荧光基团fam，突变型检测探针的5’端连接荧光基团vic。内标探针的3’端连接淬灭基团bhq2；野生型检测探针和突变型检测探针的3’端连接淬灭基团nfq，探针的3’端加入一个能插入dna小沟的小沟结合物(mgb)。
15、在一个实施例中，试剂盒中正向引物f、反向引物r、野生型检测探针和突变型探针的比例优选f:r:fam:vic＝(0.8):(0.8):(0.125):(0.25)。试剂盒中的防污染系统为37℃非热敏udg酶和dutp。pcr反应液中dntp的浓度为0.3mm，mgcl2的浓度3mm。pcr反应液还含有5％glycerol、4％dmso、2％formamide和0.3％triton 100。
16、在一个实施例中，阳性对照包括阳性对照w(ugt1a4*1野生型质粒)、阳性对照m(ugt1a4*3突变型质本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测人UGT1A4*3基因多态性的引物和探针组合物，其特征在于，所述组合物包含正向引物F、反向引物R、野生型检测探针和突变型检测探针，其中，正向引物F选自SEQ ID NO:1-3所示的核苷酸序列；反向引物R选自SEQ ID NO:4-6所示的核苷酸序列；野生型检测探针选自SEQ ID NO:7-8所示的核苷酸序列；突变型检测探针选自SEQ ID NO:9-10所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述正向引物F优选SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列，反向引物R优选SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，野生型检测探针优选SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，突变型检测探针优选SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述组合物还包含内标上游引物、内标下游引物和内标探针，其中，内标上游引物为SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；内标下游引物为SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；内标探针为SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
<...【技术特征摘要】
1.一种用于检测人ugt1a4*3基因多态性的引物和探针组合物，其特征在于，所述组合物包含正向引物f、反向引物r、野生型检测探针和突变型检测探针，其中，正向引物f选自seq id no:1-3所示的核苷酸序列；反向引物r选自seq id no:4-6所示的核苷酸序列；野生型检测探针选自seq id no:7-8所示的核苷酸序列；突变型检测探针选自seq id no:9-10所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述正向引物f优选seq idno:2所示的核苷酸序列，反向引物r优选seq id no:6所示的核苷酸序列，野生型检测探针优选seq id no:7所示的核苷酸序列，突变型检测探针优选seq id no:9所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的引物和探针组合物，其特征在于，所述组合物还包含内标上游引物、内标下游引物和内标探针，其中，内标上游引物为seq id no:11所示的核苷酸序列；内标下游引物为seq id no:12所示的核苷酸序列；内标探针为seq id no:13所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的引物和探针组合物，其特征在于，所有检测探针5’端均连接发光报告基团，发光报告基因选自rox、fam或vic；所有检测探针3’端均连接磷酸基团和能够吸收5...
【专利技术属性】
技术研发人员：史天陆，李会婷，吴妍，
申请(专利权)人：安徽省立医院中国科学技术大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。