【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种用于细胞检测mirna155和fen1的荧光传感器及其制备方法。
技术介绍
1、瓣状核酸内切酶-1(flap endonuclease-,fen1)是一种能特异性剪切双链dna5`-端单链突出分支链的核酸内切酶，其剪切特异性基于独特的dna分支结构而不依赖序列。fen1广泛分布于细胞核和细胞质中，具有稳定的剪切活性，在冈崎片段的成熟和碱基切除修复中有着不可替代的作用。在增生活跃的组织中观察到fen1的表达升高，在乳腺癌、肺癌和胃癌的肿瘤细胞中也有fen1表达的上调，提示了fen1在肿瘤发生中的重要作用。当前大多fen1的检测方法不能检测活的单细胞中fen1的表达水平，仅能检测肿瘤细胞裂解液中的fen1活性，而细胞内原位成像的检测方法多为利用fen1剪切带有荧光基团的报告探针产生信号，缺少信号放大的步骤，如何更灵敏地反映单个肿瘤细胞中fen1的表达水平还有待更进一步的探索。
2、微小rna(micro rna,mirna)是一类在细胞生长发育的遗传调节中有着重要调节作用的非编码小rna。mirna在细胞核内转录，成熟后通过碱基互补配对结合到相应的mrna位点上调节基因的表达。多种mirna与肿瘤的发生发展密切相关，通过检测mirna的表达水平可以将肿瘤组织与正常组织区分开来。在多种mirna序列中，mirna155在许多肿瘤中过表达，通过抑制细胞凋亡途径，促进肿瘤发生发展，在乳腺癌，结肠癌，甲状腺癌，肺癌等多种实体肿瘤中表达升高，提示预后不良。在单细胞水平检测mirna155在活细胞中的
3、随着纳米材料和dna编码技术的应用，在细胞内原位检测mirna或fen1取得了重大进展。在细胞内检测fen1可通过纳米材料负载dna探针，经过fen1的剪切而产生荧光信号或触发后续的信号放大反应。因mirna在细胞中的表达量很低，在细胞内原位检测mirna需要设计一系列的信号放大策略，常见的等温扩增方法如滚环扩增(rolling circleamplification,rca)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,rpa)等，可实现细胞内微量核酸分子的检测。虽然目前在mirna或fen1的单独检测中取得了显著的进展，但这些方法大多需要繁琐的纳米材料合成和修饰，或需要多种酶的参与，而且不能在细胞内同步检测mirna和fen1。而在细胞内同步检测两种生物分子的方法中，已有同步检测mirna和端粒酶的方法，而端粒酶和fen1的酶活性并不相同，这些方法不能满足mirna和fen1的同步检测。
技术实现思路
1、基于以上所述的技术，我们设计了一种双靶标级联的检测方案，在mirna155和fen1同时存在时，由mirna155打开dna发夹1，再与dna发夹2结合后由fen1剪切，去除5`-端分支后形成带有pam序列的dna双链，激活cas12a并通过反式切割报告探针产生显著的荧光信号输出。此方案通过mirna155和fen1的逻辑门控策略，可实现对两种生物分子更特异的检测，cas12a的加入保证了稳定的信号输出，有望为区分肿瘤组织和正常组织，以及探索两种生物分子的相互作用提供新的思路。
2、与目前的mirna或fen1检测方法相比，本专利技术的益处在于：
3、本方法与细胞外检测mirna或fen1的方法相比，可实现细胞环境的靶标检测，不破坏细胞的完整性，能提供更全面直观的肿瘤细胞信息。
4、本方法与细胞内单独检测mirna或fen1的方法相比，可实现二者的同步检测。通过mirna启动dna探针的组装，形成fen1的剪切产物，再通过crispr/cas12a系统进行信号放大。mirna和fen1的同步检测，可反应更全面的肿瘤信息，提高肿瘤细胞筛选的特异性，在研究mirna和fen1的相互作用中有着一定的应用价值。
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1.一种双靶标级联门控激活的CRISPR/Cas12a系统检测microRNA155和FEN1，其特征在于，所述的两个DNA发夹的识别组装和酶切，通过酶切产物激活Cas12a产生荧光信号；DNA发夹1包括miRNA155的识别部分、DNA发夹2的隐藏立足点和部分Cas12a激活链，DNA发夹2包括与DNA发夹1隐藏立足点结合部分和部分Cas12a激活链。
2.如权利要求1所述的级联门控激活的CRISPR/Cas12a系统，其特征在于，所述DNA发夹1的核苷酸序列如表1HP1所示。
3.如权利要求1所述的级联门控激活的CRISPR/Cas12a系统，其特征在于，所述DNA发夹2的核苷酸序列如表1HP2所示。
4.如权利要求1所述的级联门控激活的CRISPR/Cas12a系统的制备方法，其特征在与，所述制备方法包括：将DNA分别退火后备用，在缓冲体系中加入T4连接酶，加入退火后的DNA发夹，将Cas12a与crRNA混合孵育后加入上述反应体系，加入F-Q报告探针，即得所述的级联门控激活的CRISPR/Cas12a系统。
5.如权利要求4
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，孵育温度为37℃。
7.一种荧光检测方法，采用权利要求1所述的一种级联门控激活的CRISPR/Cas12a系统和/或权利要求4所制备得到的荧光体系。
8.如权利要求6所述的荧光检测方法，其特征在于，所述测定方法包括：将比色皿用无水乙醇浸泡，再用DEPC处理水清洗，设置参数包括激发波长、检测发射波长、电压、狭缝、扫描速率等，比色皿中加入DEPC处理水，进行调零，将反应液加入比色皿中，点击检测获得荧光信号数值。
...【技术特征摘要】
1.一种双靶标级联门控激活的crispr/cas12a系统检测microrna155和fen1，其特征在于，所述的两个dna发夹的识别组装和酶切，通过酶切产物激活cas12a产生荧光信号；dna发夹1包括mirna155的识别部分、dna发夹2的隐藏立足点和部分cas12a激活链，dna发夹2包括与dna发夹1隐藏立足点结合部分和部分cas12a激活链。
2.如权利要求1所述的级联门控激活的crispr/cas12a系统，其特征在于，所述dna发夹1的核苷酸序列如表1hp1所示。
3.如权利要求1所述的级联门控激活的crispr/cas12a系统，其特征在于，所述dna发夹2的核苷酸序列如表1hp2所示。
4.如权利要求1所述的级联门控激活的crispr/cas12a系统的制备方法，其特征在与，所述制备方法包括：将dna分别退火后备...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜玉蓉，贾恒轲，吴海平，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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