【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物离体培养，具体涉及到一种快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法。
技术介绍
1、梨属(pyrus)植物在我国种质资源十分丰富，为满足消费者需求，育种工作者通过杂交、芽变选种、实生选种、诱变等多种育种方式选育出了大量各具特色的优质梨品种。据统计，在1984-2015年期间，我国育成梨新品种126个。组织培养技术是近几十年来发展起来的一项无性繁殖新技术，又叫离体培养，是指从植物体分理出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种于含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的方法。采用组织培养技术，不仅可以对不同品种及种质的优良性状进行室内保存，而且还能够消除季节因素的限制，提高繁殖系数，为优质种质的快速繁殖及脱毒苗的获得提供前提，此外，离体植株还为室内基础研究及遗传转化实验提供材料，具有重要的应用价值。
2、但是，离体培养中外植体消毒大多使用升汞或次氯酸钠为主要消毒剂，升汞的杀菌效果极好，但是毒性较大，无法保证安全使用。次氯酸钠虽然毒性较小但杀菌效果一般，且梨属于多糖多酚类植物，极易褐化，次氯酸钠的使用在满足杀菌效果的同时会造成较高的褐化率，不易获得成活的健壮离体植株。因此，采用已有的消毒手段，以梨幼嫩新梢茎段为外植体，采用升汞或次氯酸钠消毒获得的离体培养试管苗的方法效率不高。对此，专利号为cn 115843689a的现有技术采用75％的乙醇对一年生梨树枝条浸泡消毒，该方法避免了使用毒性较大的升汞或易导致褐化的次氯酸钠消毒，但是需
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提供一种快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，该方法将外植体腋芽的萌发周期大幅缩短至6～7天，且在无需采用杀菌效果较好的升汞的条件下即能获得较高的成活率和较低的褐化率，显著提高组培效率。
2、为解决以上技术问题，本专利技术提供一种快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，包括以下步骤：采集当年生新稍，去除叶片，水洗后用75％酒精擦拭表面，于紫外光下照射杀菌，得预处理新稍；将所述预处理新稍截成带有腋芽的茎段，依次于75％酒精和0.05％～0.1％的次氯酸钠中浸泡消毒，再经无菌水冲洗并接种至ms培养基中培养。
3、本专利技术采用当年生新稍作为外植体进行组织培养，为了避免消毒过程中造成的外植体褐化死亡，本专利技术在浸泡消毒之前通过额外的清水冲洗、酒精擦拭以及紫外光照射的方式对外植体进行预处理，将存在于枝梢表面的大部分真菌及细菌预先去除。在预处理之后，再依次采用75％酒精和较低浓度的次氯酸钠溶液进行浸泡消毒，避免了使用毒性较大的升汞。
4、结合第一方面，在采集新稍时，可以在5月份从树势健壮的梨树采集当年生新稍。本专利技术利用当年生的新稍作为外植体，与现有的采用一年生的休眠后的枝条相比，具有所需培养周期更短的优势。
5、结合第一方面，在将新稍的叶片去除后，先用清水冲洗，之后用75％酒精擦拭表面3～5遍。
6、结合第一方面，在用75％酒精擦拭表面后，于紫外光下照射杀菌，所述紫外光的强度为40～60μw/cm2，该范围的紫外光强度可有效杀灭外植体表面的细菌、病毒及真菌孢子等微生物，且不会对外植体本身造成不利影响。
7、优选地，所述紫外光的强度为50μw/cm2。
8、结合第一方面，所述照射杀菌的时长为18～22min，优选为20min。
9、真菌及细菌污染大多存在于枝梢表面，在对采集的外植体浸泡消毒之前，先依次进行水洗、酒精擦拭至少3遍和紫外灯照射的操作步骤，除掉枝梢表面大部分的菌类污染，有效降低外植体污染率。
10、结合第一方面，所述带有腋芽的茎段的长度为1.5～2.5cm，茎段的长度过长易导致内生细菌污染的增加，过短可能导致杀菌剂对腋芽基部产生额外伤害。
11、优选地，所述带有腋芽的茎段的长度为2cm。
12、结合第一方面，将带有腋芽的茎段于75％酒精中浸泡消毒55～65s。
13、结合第一方面，将带有腋芽的茎段于75％酒精中浸泡消毒后，再于0.05％的次氯酸钠中浸泡消毒3.5～4.5min。
14、本专利技术依次采用75％酒精和0.05％的次氯酸钠对茎段消毒，既避免了使用毒性较大的升汞，又可保证较高的成活率和较低的褐化率。
15、结合第一方面，所述培养为于24～26℃下光照培养16h/d。
16、优选地，所述培养为于25℃下光照培养。
17、结合第一方面，所述ms培养基中含有pvp-k30，向普通ms培养基中添加适当浓度的pvp-k30可以降低组培苗的褐化率。
18、结合第一方面，所述ms培养基中pvp-k30的浓度为3.5～4.5g/l，优选为4g/l。
19、结合第一方面，所述梨选自黄冠梨、西子绿梨、丰水梨或康弗伦斯梨。
20、本专利技术获得的有益效果：本专利技术提供的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，采用当年生新稍作为外植体进行组织培养，在培养第6～7天即萌发生长出无菌离体植株，显著缩短了培养周期。此外，本专利技术采用“75％酒精+低浓度次氯酸钠”的消毒方式，使得该方法在缩短培养周期的同时、还可保证外植体的高成活率(最高达96％以上)和低褐化率(最低为0)，污染率也均低于5％，显著提高了育苗效率；并且，该方法避免了剧毒试剂升汞的使用，大大提高了培养过程的安全性。
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1.一种快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：采集当年生新稍，去除叶片，水洗后用75％酒精擦拭表面，于紫外光下照射杀菌，得预处理新稍；
2.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，在5月份从树势健壮的梨树采集当年生新稍。
3.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述紫外光的强度为40～60μw/cm2。
4.如权利要求1或3所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述照射杀菌的时长为18～22min。
5.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述带有腋芽的茎段的长度为1.5～2.5cm。
6.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，于75％酒精中浸泡消毒55～65s。
7.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，于0.05％的次氯酸钠中浸泡消毒3.5～4.5min。
8.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株
9.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述MS培养基中含有PVP-K30。
10.如权利要求9所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述MS培养基中PVP-K30的浓度为3.5～4.5g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：采集当年生新稍，去除叶片，水洗后用75％酒精擦拭表面，于紫外光下照射杀菌，得预处理新稍；
2.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，在5月份从树势健壮的梨树采集当年生新稍。
3.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述紫外光的强度为40～60μw/cm2。
4.如权利要求1或3所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述照射杀菌的时长为18～22min。
5.如权利要求1所述的快速获得梨无菌离体植株的组织培养方法，其特征在于，所述带有腋芽的茎段的长度为1.5～2.5c...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨岳昆，王晋，王红宝，王永博，王亚茹，安硕，李勇，李晓，王迎涛，
申请(专利权)人：河北省农林科学院石家庄果树研究所，
类型：发明
国别省市：
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