【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程,涉及一种转运蛋白yaaj在提高菌株d-泛酸产量中的应用。
技术介绍
1、d-泛酸(dpa)常称为d-泛酸钙,是一种水溶性b族维生素,又称维生素b5、3-吡啶羧酸酰胺,广泛的存在于动植物中,在人体内参与脂肪的降解、柠檬酸循环、抗体的合成和脂肪酸的降解等代谢,发挥着重要的生理功能,因而在医药、保健品、化妆品、食品、饲料等领域有广泛的应用。
2、目前工业上d-泛酸钙的生产工艺有两种,分别为全化学合成法和化学合成与酶催化组合法。
3、这两种工艺都会用到中间体dl-泛酸内酯,dl-泛酸内酯大多使用化学法进行拆分,手性拆分费用昂贵,且会用到有毒的氰化物,对环境有污染和毒性问题,中国化工行业对环保的要求日益严格,对氰化物的环保要求更多,不利于产业的扩大。
4、近年来国内外许多科研人员都在研究利用基因工程菌通过发酵法生产泛酸钙,我们在公布号为cn118165902a的专利文件中公开了一种大肠杆菌发酵菌株cgmcc no.29714(编号ecoli w21),其d-泛酸钙发酵产量能达到49.95g/l。但与化学法相比,利用葡萄糖和β-丙氨酸通过发酵生产d-泛酸的成本依然很高,需要更多地提高d-泛酸钙发酵水平。
技术实现思路
1、我们在对大肠杆菌发酵生产d-泛酸钙的持续研究中,基于d-泛酸钙的生物合成途径,对于可能正向调控d-泛酸合成基因的调控因子/转运蛋白进行了系统考察,发现转运蛋白yaaj(genebank编号944745)能够促进文献c
2、本专利技术的第一方面提供了转运蛋白yaaj在提高菌株d-泛酸产量中的应用。
3、上述的应用可以为一种提高菌株d-泛酸产量的方法,包括下述步骤:使d-泛酸生产菌过表达转运蛋白yaaj(genebank编号944745),该转运蛋白yaaj的氨基酸序列为seq idno:2。
4、mpdffsfinsvlwgsvmiyllfgagcwftfrtgfvqfryirqfgkslknsihpqpggltsfqslctslaarvgsgnlagvalaitaggpgavfwmwvaafigmatsfaecslaqlykerdvngqfrggpawymarglgmrwmgvlfavflliaygiifsgvqanavaralsfsfdfpplvtgiilavftllaitrglhgvarlmqgfvplmaiiwvltslvicvmnigqlphviwsifesafgwqeaaggaagytlsqaitngfqrsmfsneagmgstpnaaaaaaswpphpaaqgivqmigifidtlvictasamlillagngttymplegiqliqkamrvlmgswgaefvtlvvilfafssivanyiyaennlfflrlnnpkaiwclrictfatviggtllslplmwqladiimacmaitnltailllspvvhtiasdylrqrklgvrpvfdplrypdigrqlspdawddvsqe(seq id no:2)。
5、优选地,上述d-泛酸生产菌是大肠杆菌工程菌。
6、可选地,上述大肠杆菌工程菌的宿主菌是公布号为cn118165902a的专利文件中报道的菌株ecoli w21即cgmcc no.29714。
7、在一种实施方式中,上述转运蛋白yaaj(genebank编号944745)的编码基因的核苷酸序列为seq id no:1。
8、上述方法中,大肠杆菌工程菌过表达所述转运蛋白yaaj(genebank编号944745)可以通过下述方式实施:
9、a.在d-泛酸生产菌宿主菌基因组中所述转运蛋白yaaj的上游插入强启动子;
10、b.在d-泛酸生产菌宿主菌基因组中整合一个以上、优选两个以上、三个以上、四个以上、六个以上、八个以上拷贝的拷贝所述转运蛋白yaaj的编码基因;并且/或者
11、c.在d-泛酸生产菌宿主菌基因组中以质粒形式表达转运蛋白yaaj的编码基因。
12、可选地,上述步骤a或b是通过将包含所述转运蛋白yaaj编码基因的重组质粒转化入宿主菌中而实现,优选质粒载体是ptrc99a。所述重组质粒例如是本文中的ptrc99a-yaaj。
13、在一种实施方式中,上述步骤a中所述强启动子的插入方式、步骤b中所述基因组中的转运蛋白yaaj编码基因整合方式选自质粒转化和基因编辑技术。
14、在该重组质粒转化入宿主菌细胞后,该转运蛋白yaaj编码基因可以整合在染色体上的多拷贝序列位点或者多个位点。
15、上述基因编辑技术可以选自下组:同源双交换,talen系统,crispr-cas9系统,crispr-cpf1系统,crispr-cas12系统,crispr-best系统,mugent(multiplex genomeediting by natural transformation,通过自然转化进行多重基因组编辑)等。
16、本专利技术的第二个方面提供了一种用于构建上述过表达所述转运蛋白yaaj的大肠杆菌工程菌的重组质粒(或称重组载体),该质粒载体是适合于在细菌例如大肠杆菌中表达外源基因的质粒,并且包含所述转运蛋白yaaj编码基因。
17、该重组质粒的质粒载体/骨架是ptrc99a或者选自pet系列,比如载体是pet22b、pet24a、pet28a等,但并不受限于此。
18、优选地,重组质粒是本文中的ptrc99a-yaaj,其核苷酸序列如seq id no:3所示。
19、本专利技术的第三个方面提供了一种过表达上述转运蛋白yaaj的大肠杆菌工程菌,其基因组中整合了如上所述的转运蛋白yaaj编码基因;或者是在宿主菌中转化了如上所述重组质粒的转化子,并且该宿主菌本身是d-泛酸生产菌例如是保藏编号为cgmccno.29714的大肠杆菌。
20、本专利技术的第四个方面提供了上述大肠杆菌工程菌在发酵法生产d-泛酸中的用途。
21、本专利技术发现了来源于大肠杆菌例如escherichia coli mg1655的转运蛋白yaaj(genebank编号944745)对于菌株合成d-泛酸具有正调控作用,实验表明其在d-泛酸生产菌中过表达能够有效提高d-泛酸产量,发酵水平相较可以提高20%,具有良好的工业应用前景。
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1.转运蛋白yaaJ在提高菌株D-泛酸产量中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其为一种提高菌株D-泛酸产量的方法,其特征在于,包括下述步骤:使D-泛酸生产菌过表达转运蛋白yaaJ(GeneBank编号944745),该转运蛋白yaaJ的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述D-泛酸生产菌是大肠杆菌工程菌。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述转运蛋白yaaJ的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,过表达所述转运蛋白yaaJ通过下述方式实施:
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,步骤B是通过将包含所述转运蛋白yaaJ编码基因的重组质粒转化入宿主菌中而实现。
7.一种如权利要求6中所述的重组质粒,其特征在于,该质粒载体是适合于在细菌例如大肠杆菌中表达外源基因的质粒,并且包含所述转运蛋白yaaJ的编码基因。
8.如权利要求7所述的重组质粒,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。<
9.一种过表达如权利要求1中所述转运蛋白yaaJ的大肠杆菌工程菌,其特征在于,在基因组中整合了转运蛋白yaaJ的编码基因;或者是在宿主菌中转化了如权利要求7或8所述重组质粒的转化子,并且该宿主菌是D-泛酸生产菌。
10.如权利要求9所述大肠杆菌工程菌在发酵法生产D-泛酸中的用途。
...【技术特征摘要】
1.转运蛋白yaaj在提高菌株d-泛酸产量中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其为一种提高菌株d-泛酸产量的方法,其特征在于,包括下述步骤:使d-泛酸生产菌过表达转运蛋白yaaj(genebank编号944745),该转运蛋白yaaj的氨基酸序列为seq id no:2。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述d-泛酸生产菌是大肠杆菌工程菌。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述转运蛋白yaaj的编码基因的核苷酸序列为seq id no:1。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,过表达所述转运蛋白yaaj通过下述方式实施:
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员:王金刚,任亮,步绪亮,梁岩,韦炎龙,
申请(专利权)人:上海邦林生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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