【技术实现步骤摘要】
本申请属于基因工程与分析检测领域，涉及单质粒t7表达系统的构建方法，具体地，涉及一种构建t7 rnap表达单元的方法，以及调整设计的t7 rnap表达单元的dna结构以成功构建t7 rnap表达单元的方法。即，本申请提供了1、一种预测在大肠杆菌中能够成功构建单质粒t7表达系统的t7 rnap含量(活性)的上限值方法；2、一种预测在宿主菌中能够成功构建单质粒t7表达系统的t7 rnap含量(活性)的上限值方法(下称预测t7rnap致死上限值方法)；3、通过检测t7 rnap活性，基于各宿主t7 rnap活性上限值，提供一种快速定制化构建单质粒t7表达系统的方法。
技术介绍
1、t7表达系统是一种基于噬菌体t7 rna聚合酶(t7 rnap)的高效表达系统，可实现蛋白质的高水平表达。其主要由t7启动子和t7 rnap两种元件构成，该系统最主要的特点在于t7 rnap具有超强活性，并且对t7启动子有高度特异性，从而指导t7启动子下游基因高水平转录。此外，该系统遗传操作简单、基因调控严谨，易操作，因此被广泛应用于合成生物学，代谢工程，生物医学，酶工程，rna合成及mrna疫苗等领域。
2、长期以来，研究者希望把表达t7 rnap基因元件(本专利称为“t7 rnap表达单元”)与t7启动子和其下游被转录的基因(本专利称为“t7启动子转录单元”)放置在同一个质粒上，这既可以构建不同宿主通用的正交转录系统，还免去了将t7 rnap基因整合到宿主基因组上的操作。研究表明，因t7rnap的高转录活性，t7 rnap基因与t7启动子放置
3、为了构建一套不依赖宿主的单质粒t7表达系统，方便t7表达系统在不同宿主中的应用，本专利基于合成生物学模块化思想，开发一种快速构建单质粒t7表达系统的方法。根据各种宿主的不同特性，快速构建单质粒t7表达系统，实现t7表达系统在宿主中的应用，大大简化了构建单质粒t7表达系统的操作流程。
技术实现思路
1、基于此，针对现有技术中t7表达系统在非模式宿主中应用过程较复杂，而单质粒t7表达系统构建过程耗时长，成功率低的问题，本申请提供了一种考虑到不同宿主的特性，针对宿主的个性化特点，在宿主中快速构建单质粒t7表达系统的方法，本申请提供的方法能够更快速的在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中构建单质粒t7表达系统表达外源蛋白。此外，本申请还提供了一种预测宿主中t7 rnap致死上限值的方法，本申请提供的致死上限值预测方法，能够有效预测各宿主细胞中t7 rnap可使t7表达系统构建成功并存活的活性上限值，从而指导单质粒t7表达系统在其中的快速构建。
2、具体来说，本申请涉及以下内容：
3、1.一种构建t7 rnap表达单元的方法，其包括以下步骤：
4、a.设计t7 rnap表达单元；
5、b.将设计的t7 rnap表达单元插入测试质粒；
6、c.使所述测试质粒在宿主细胞中表达t7 rnap；
7、d.测定通过测试质粒表达的t7 rnap活性e；
8、e.判定所述t7 rnap活性e是否小于所述宿主细胞中t7 rnap活性的阈值e0；
9、f1.如果所述e<e0，则成功构建t7 rnap表达单元；
10、f2.如果所述e≥e0，则调整所述设计的t7 rnap表达单元的dna结构，并重复步骤b-e，直到判定e<e0，则成功构建t7 rnap表达单元；
11、g.选择所述t7 rnap活性低于e0值的质粒。
12、2.根据项1所述的方法，其中，所述t7 rnap表达单元包含：启动子序列、rbs序列、t7 rnap编码基因、终止子序列。
13、3.根据项1所述的方法，其中，在f2步骤中，调整所述设计的t7 rnap表达单元的dna结构的方法选自以下中任一个或两个以上，以降低t7rnap的表达量和表达活性：
14、更改启动子，
15、突变启动子，
16、设计rbs结构，
17、更改rbs至t7 rnap编码基因的起始密码子的距离，
18、将t7 rnap编码基因中的密码子更改为稀有密码子，
19、更改t7 rnap编码基因的终止子，
20、更改质粒拷贝数，
21、设计抑制t7 rnap表达的反义rna，
22、在t7 rnap表达单元的启动子下游插入能导致t7 rnap转录强度减弱的序列，
23、在t7 rnap表达单元下游插入干扰t7 rnap基因转录过程的转录干扰结构，或
24、突变t7 rnap编码基因。
25、4.根据项1所述的方法，其中，所述测试质粒选自：puc类高拷贝质粒、pet类中拷贝质粒、pbbrmcs类广泛宿主质粒、pbl类低拷贝质粒、pye质粒、pyc质粒、prs质粒或pgex质粒。
26、5.根据项1所述的方法，其中，所述宿主细胞选自：革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌；优选为，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、地衣芽孢杆菌、中华根瘤菌、塔本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建T7 RNAP表达单元的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述T7 RNAP表达单元包含：启动子序列、RBS序列、T7 RNAP编码基因、终止子序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在f2步骤中，调整所述设计的T7 RNAP表达单元的DNA结构的方法选自以下中任一个或两个以上，以降低T7 RNAP的表达量和表达活性：
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试质粒选自：pUC类高拷贝质粒、pET类中拷贝质粒、pBBRMCS类广泛宿主质粒、pBL类低拷贝质粒、pYE质粒、pYC质粒、pRS质粒或PGEX质粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞选自：革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌；优选为，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、地衣芽孢杆菌、中华根瘤菌、塔特姆菌或严格嗜盐菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，测定T7 RNAP活性的方法为TX-TL检测法。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞中T7 RNAP活性的阈值E0：在革
8.根据权利要求3所述的方法，其中更改启动子是指：将原有的启动子更改为以下启动子：lacUV5启动子、lac启动子、tac启动子、Trc启动子、Trp启动子、Pc启动子或J23112启动子。
9.根据权利要求3所述的方法，其中突变启动子是指：对原有的启动子序列进行核苷酸的插入、缺失或替换。
10.一种调整所述T7 RNAP表达单元的DNA结构的方法，其包括以下中任一个或两个以上：
...【技术特征摘要】
1.一种构建t7 rnap表达单元的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述t7 rnap表达单元包含：启动子序列、rbs序列、t7 rnap编码基因、终止子序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在f2步骤中，调整所述设计的t7 rnap表达单元的dna结构的方法选自以下中任一个或两个以上，以降低t7 rnap的表达量和表达活性：
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试质粒选自：puc类高拷贝质粒、pet类中拷贝质粒、pbbrmcs类广泛宿主质粒、pbl类低拷贝质粒、pye质粒、pyc质粒、prs质粒或pgex质粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞选自：革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌；优选为，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、地衣芽孢杆菌、中华根...
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