【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，属于化妆品原料性能测试。
技术介绍
0、技术背景
1、衰老是人体的自然生理现象，涉及许多生理学过程。衰老学说包括自由基学说、炎性学说、免疫学说等。皮肤受外界刺激易产生氧化应激反应，相关研究表明，氧化应激可诱发机体衰老，因此开发相应的抗衰日化品是必要的，且符合当前市场趋势。目前日化品的竞争力核心主要来源于原料，筛选有效的抗衰原料是产品开发的有效保障，故本专利提供一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，为抗衰老原料的筛选提供一定的理论依据。
2、该方法符合3r原则，弥补了传统方法试验周期长，检测成本高的缺点，有利于实现抗衰原料的快速筛选。皮肤衰老的原因是真皮层，真皮层主要由成纤维细胞构成；h2o2是一种经典的氧化应激诱导剂，可导致机体产生一系列氧化应激反应，如衰老、皱纹等。故本方法选用h2o2刺激hdfa细胞建立衰老模型。
3、该方法检测炎症因子分别为il-6和il-8，该指标符合炎症性衰老评价；线粒体膜电位变化是细胞早期衰老的标志之一，检测该指标，能够有效筛选出具有抵抗细胞早期衰老的原料；mmp-1在衰老过程中发挥重要作用，是降解ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白最主要的酶，当mmp-1过度表达时，特异性降解细胞外基质成分，破坏胶原纤维和弹性纤维的正常结构，导致皮肤出现皱纹等衰老表现，是筛选抗衰老原料必不可少的评价指标。
4、该方法通过以上典型指标，通过综合评分系统进行评分，筛选出最优的抗衰老原料，弥补了目前化妆品抗衰原料筛选的单一性。该综合评估系统为抗衰原料的
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术缺陷，提供一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，该方法选用典型的炎症因子作为炎症性衰老指标；选用线粒体膜电位变化作为早期衰老指标；再选用重要的衰老指标mmp-1，通过评分系统，综合筛选化妆品抗衰老原料，具有高效、快速、全面的优势。
2、实现上述目的的技术方案是：一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，对目标原料的抗衰老活性进行筛选，具体包括以下步骤：
3、s1，评估受试物的溶解性，确定溶解方案；
4、s2，培养hdfa细胞；
5、s3，hdfa细胞活性检测，确定受试物检测浓度，包括以下工序：
6、s31，取步骤s2中对数生长期hdfa细胞接种培养16h～24h，加入受试物，所述受试物检测包含多个浓度梯度，空白组为不添加任何样品的培养基溶液，培养16h～24h，加入mtt检测吸光度，计算细胞存活率；
7、s32，按照步骤s31筛选得到hdfa细胞模型细胞存活率为90％(cv90)时对应的受试物浓度，设定该浓度为后续抗衰老检测的给药浓度；
8、s4，取步骤s2中对数生长期的hdfa细胞，培养16～24h，分别设置空白组、模型组及样品组。空白组加入完全培养基，模型组及样品组加入用完全培养基稀释的h2o2溶液，培养1～3h后，弃去培养基，每孔加入1～2ml的缓冲液清洗2～4分钟，清洗1～3次，空白组及模型组加入完全培养基，样品组加入由完全培养基稀释的步骤s32中cv90对应的受试物浓度，培养16～24h，分别收集上清液及hdfa细胞。
9、s5，取步骤s4中的上清液检测炎症因子il-6、il-8及金属蛋白酶mmp-1的含量。
10、s6，取步骤s4中收集的hdfa细胞，检测线粒体膜电位，并记录高电位及低电位细胞分布。
11、s7，汇总步骤s5中il-6、il-8含量测定结果及mmp-1含量测定结果，计算样品组含量及模型组含量比值，得到其相对表达量；汇总步骤s6中高、低电位细胞分布情况；以上均应用graphpad prism作图，结果表示为mean±sd；各组间比较采用one-way anova统计分析。
12、p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抑制作用，评分为0.33；
13、p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抑制作用，评分为0.67；
14、p<0.001认为具有极其显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极显著抑制作用，评分为1.0；
15、根据上述评分标准，分别得出炎症性衰老指标il-6、il-8、典型衰老指标mmp-1及早期衰老指标线粒体膜电位分布的分值，将各分值相加后÷4，求平均值，若平均值≥0.5则认为受试物抗衰老活性较好。
16、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，步骤s1中，水溶性样品直接溶于完全培养基；非水溶性样品先用二甲基亚砜配置高浓度，再用完全培养基稀释至作用浓度；溶解过程中根据受试物的特性，可采用高温、超声等辅助溶解方式。
17、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积分数不得超过加样总体积的0.1％。
18、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，步骤s2中，hdfa细胞培养采用的完全培养基的配置方式为90％ fibroblast basal medium+10％fbs，培养条件:温度为37±0.5℃，co2浓度为(5±1)％。
19、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，步骤s31中，hdfa细胞接种于96孔板中，接种细胞悬液密度为0.5～2.0×104个/ml，每孔接种100ul，受试物设置5～8个浓度梯度，每个浓度设3个及以上复孔。
20、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，步骤s4中，hdfa细胞以3～5×104个细胞/ml接种于6孔板，每孔加入2ml细胞悬液，培养24h。
21、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，步骤s4中，h2o2浓度为50～200umol/l，所述缓冲液为pbs溶液。
22、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，步骤s5中，炎症因子il-6、il-8和金属蛋白酶mmp-1含量检测使用elisa试剂盒。
23、上述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，步骤s6中，线粒体膜电位检测采用流式细胞术，染色剂为jc-1。
24、本专利技术的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，包含多个衰老的典型指标，将各个指标纳入综合评分系统，提供了全面、快速、高效的抗衰老筛选方法，弥补了传统单一指标的不足，为日化产品抗衰老活性原料的前期验证、开发、筛选提供相对全面的评价方法，为抗衰老原料的复配提供相应的依据，也为开发较好的具有抗衰老功效的护肤品提供有力的保障。
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1.一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，基于H2O2损伤HDFa细胞衰老模型检测结果，对目标原料的抗衰活性进行筛选，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤S1中，水溶性样品直接溶于完全培养基；非水溶性样品先用二甲基亚砜配置高浓度，再用完全培养基稀释至最终作用浓度；溶解过程中根据受试物的特性，可采用高温、超声等辅助溶解方式。
3.根据权利要求3所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积分数不得超过加样总体积的0.1％。
4.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，HDFa细胞培养采用的完全培养基的配置方式为90％Fibroblast Basal Medium+10％FBS，培养条件:温度为37±0.5℃，CO2浓度为(5±1)％。
5.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤S31中，HDFa细胞接种于96孔板中，接种细胞悬液密度为0.5～2.0×104个/mL，每孔接种
6.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤S4中，HDFa细胞以3～5×104个细胞/mL接种于6孔板，每孔加入2mL细胞悬液，培养24h。
7.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤S4中，H2O2浓度为50～200umol/L，所述缓冲液为PBS溶液。
8.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤S5中，炎症因子IL-6、IL-8和金属蛋白酶MMP-1含量检测使用ELISA试剂盒。
9.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤S6中，线粒体膜电位检测采用流式细胞术，染色剂为JC-1。
...【技术特征摘要】
1.一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，基于h2o2损伤hdfa细胞衰老模型检测结果，对目标原料的抗衰活性进行筛选，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤s1中，水溶性样品直接溶于完全培养基；非水溶性样品先用二甲基亚砜配置高浓度，再用完全培养基稀释至最终作用浓度；溶解过程中根据受试物的特性，可采用高温、超声等辅助溶解方式。
3.根据权利要求3所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积分数不得超过加样总体积的0.1％。
4.根据权利要求1所述的一种化妆品抗衰老原料的筛选方法，其特征在于，步骤s2中，hdfa细胞培养采用的完全培养基的配置方式为90％fibroblast basal medium+10％fbs，培养条件:温度为37±0.5℃，co2浓度为(5±1)％。
5.根据权利要求1所述的一种化妆品抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：张蓉蓉，王飞飞，马骁，郭振宇，
申请(专利权)人：云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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