【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物物质分离，具体涉及温敏特异性多肽和基于温差特异性无损分离外泌体的方法。
技术介绍
1、外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的双层磷脂膜囊泡，在生理和病理过程中均发挥着重要作用，研究人员现已探明其在治疗及检测等方面具有巨大的应用潜力。高纯度的外泌体是进行外泌体研究及应用的基础，如何有效地分离外泌体一直是科研人员关注的重点。目前，外泌体分离技术主要有基于物理分离方法的超速离心法、超滤法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法，以及基于生化分离方法的亲和分离方法。
2、基于密度、尺寸大小等物理性质的分离方法，如超速离心法，是外泌体分离的常用方法。该法基于体液中各种物质密度梯度差异，通过离心力达到分离、富集外泌体的目的。超速离心法相对简单，不被分离试剂污染，获得的外泌体数量较多，目前仍被广泛使用。但该法所需的离心仪器较贵，样品量大，耗时长，且分离的外泌体纯度不高。
3、超滤法是利用外泌体的特定尺寸，使用具有不同截留孔径的超细纳米过滤膜将特定尺寸物质截留在超滤膜上，小粒径物质过滤到膜的另一侧。超滤法操作简单，可浓缩外泌体样品，其成本低，速度快。申请号为cn202310735921.1的专利申请公开了一种分离提纯外泌体的技术方案，其中，采用超声纳滤方法在加压或震动过程中，可能会导致外泌体受到机械损伤力，破坏其活性结构；且过滤膜容易被大分子物质堵塞，导致滤膜压力过大而破碎。
4、大量具有同样尺寸、密度等物理性质的非外泌体颗粒会造成物理分离方法得到的外泌体含有大量的污染，如囊泡类的凋亡小体、外囊泡，以及
5、亲和分离方法是一种利用分子对之间的特异性相互作用力，共价修饰在固相载体上的分子将另一配对分子进行捕获的分离方法。利用该原理分离外泌体是将外泌体表面特异性标志物的结合分子，如蛋白、多肽或适配体，共价修饰在固相载体表面（如磁珠或微球），在与外泌体孵育结合后，将外泌体从液相中分离洗脱，进而达到分离富集的目的。该方法优势在于具有高特异性，操作简便，相比于其他分离方法分离的外泌体纯度更高。但外泌体在结合配体分子后，需要极端或复杂的解离条件，如免疫抗体结合外泌体标志物蛋白（cd63、cd9、cd81等）后，需要在ph约为3.0左右进行，无法得到结构完整的外泌体，其功能性将会损失，且存在蛋白类的物质损伤活性或聚集等风险。在申请号为cn201580066077.1的专利申请的技术方案中，基于tim蛋白质与磷脂酰丝氨酸特异性结合后，需要加入高浓度的edta-2na，螯合分子间的桥接作用的钙离子，使得外泌体得以洗脱，但游离配体可能会影响后续使用，进一步分离将造成分离效率较低。
6、综上所述，目前缺乏一种高效且特异性的外泌体无损分离方法，使得外泌体相关研究与应用发展严重受阻。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术提供温敏特异性多肽和基于温差特异性无损分离外泌体的方法，至少解决现有技术中的一个问题。
2、第一方面，本专利技术提供一种温敏特异性多肽，其氨基酸序列如seq id no.1、seqid no.2或seq id no.3所示。
3、温敏特异性多肽是一种能与外泌体表面标志物特异性亲和的多肽，该多肽的二级结构受温度调控，使得在低温（2~8℃）时，能与外泌体表面标志物蛋白特异性结合；在温度较高（25~37℃）时，将与外泌体表面标志物蛋白发生解离，其亲和力具有温度敏感性。温敏特异性多肽的氨基酸序列如表1所示，其中，seq id no.1对应的多肽为cd63蛋白特异性多肽；seq id no.2对应的多肽为cd9蛋白特异性多肽；seq id no.3对应的多肽为cd81蛋白特异性多肽。seq id no.1对应的多肽在低温条件下（2~8℃）特异性结合cd63蛋白（外泌体表面特异性标志蛋白之一），并在较高温度下（25~37℃）发生解离。seq id no.2对应的多肽在低温条件下（2~8℃）特异性结合cd9蛋白（外泌体表面特异性标志蛋白之一），并在较高温度下（25~37℃）发生解离。seq id no.3对应的多肽在低温条件下（2~8℃）特异性结合cd81蛋白（外泌体表面特异性标志蛋白之一），并在较高温度下（25~37℃）发生解离。
4、表1 温敏特异性多肽的氨基酸序列
5、
6、第二方面，本专利技术提供所述温敏特异性多肽在分离外泌体中的应用。
7、第三方面，本专利技术提供一种基于温差特异性无损分离外泌体的方法，其包括以下步骤：
8、用温敏特异性多肽修饰纳米磁性微球，得到多肽修饰的纳米磁性微球；
9、将含有外泌体的液体与多肽修饰的纳米磁性微球混合，在2~8℃下孵育，使得外泌体与多肽修饰的纳米磁性微球结合，在磁场作用下多肽修饰的纳米磁性微球将外泌体从液体中捕获分离，通过清洗去除非特异性吸附物质；之后在25~37℃下孵育，使得外泌体与多肽修饰的纳米磁性微球发生解离，通过磁分离去除多肽修饰的纳米磁性微球，得到分离提纯的外泌体；
10、其中，温敏特异性多肽的氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。
11、需要说明的是，含有外泌体的液体是指待分离提纯外泌体的液体，其中含有外泌体。例如，含有外泌体的液体可以是血清、无血清细胞培养基上清、尿液等生物体液。清洗可以是使用生理盐水清洗，非特异性吸附物质是指不与外泌体蛋白标志物（cd63、cd9及cd81等）相关的物质。
12、在一些可选的实施例中，在2~8℃下孵育的时间为1~12小时。
13、在一些可选的实施例中，在25~37℃下孵育的时间为10~15分钟。
14、在一些可选的实施例中，用温敏特异性多肽修饰纳米磁性微球包括：
15、将聚合物单体、引发剂和油酸修饰的fe3o4纳米颗粒混合，得到环氧基聚合物磁性微球；
16、使温敏特异性多肽和三(2-羧乙基)膦（tcep）反应，得到巯基还原态的温敏特异性多肽；
17、使还原态的巯基还原态的温敏特异性多肽和环氧基聚合物磁性微球反应，得到多肽修饰的纳米磁性微球。
18、在一些可选的实施例中，聚合物单体包括苯乙烯、二乙烯基苯中的至少一种，还包括丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的至少一种。优选地，聚合物单体包括苯乙烯、二乙烯基苯和丙烯酸缩水甘油酯。
19、在一些可选的实施例中，引发剂为偶氮二异丁腈。
20、在一些可选的实施例中，温敏特异性多肽通过以下步骤获得：
21、以外泌体标志物蛋白cd63、cd9或cd81为靶蛋白，通过噬菌体展示技术筛选得到展示多肽的单克隆噬菌体；
22、将单克隆噬菌体分别与外泌体标志物蛋白cd63、cd9或cd81在2~8℃下孵育结合，然后在25~37℃下解离洗脱，通过对洗脱的单克隆噬菌体进行测序，筛选得到在2~8℃下与外泌体标志物蛋白cd63、cd9或cd81结合且在25~37℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种温敏特异性多肽，其特征在于，所述温敏特异性多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的温敏特异性多肽在分离外泌体中的应用。
3.一种基于温差特异性无损分离外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在2~8℃下孵育的时间为1~12小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在25~37℃下孵育的时间为10~15分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用温敏特异性多肽修饰纳米磁性微球包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚合物单体包括苯乙烯、二乙烯基苯中的至少一种，还包括丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述聚合物单体包括苯乙烯、二乙烯基苯和丙烯酸缩水甘油酯。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
10.根据权利要求3所述的方法，其
...【技术特征摘要】
1.一种温敏特异性多肽，其特征在于，所述温敏特异性多肽的氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2或seq id no.3所示。
2.根据权利要求1所述的温敏特异性多肽在分离外泌体中的应用。
3.一种基于温差特异性无损分离外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在2~8℃下孵育的时间为1~12小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在25~37℃下孵育的时间为10~15分钟。
6.根据权利...
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