【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种目标祖先酶的挖掘方法及其应用，属于酶工程。
技术介绍
1、近几十年来，基因工程和蛋白质工程的进步推动了生物催化领域的发展，展示了其作为传统化学反应的环保替代品的潜力。然而，天然来源的酶通常需要人为强化才能满足特定的催化需求。其中，耐热酶因其能够耐受高温和延长反应时间而具有特殊重要性，使其在各种应用中非常受欢迎。由于来自极端生物的极端酶表现出很好耐热性，探索极端酶资源是一种能够满足各种高性能催化应用需求最直接的方法。例如，来自嗜热细菌thermusaquaticus的taq dna聚合酶已成为著名的热稳定性dna聚合酶(brock,t.d.et al.journalof bacteriology 98(1),289-97)。来自嗜热细菌herbinix hemicellulosilytica的嗜热木聚糖酶在纤维素和木制品的高温加工中具有应用潜力(mechelke,m.et al.journalofbiotechnology 257,122-130)。此外，ni等人利用来自嗜热菌amycolatopsisthermoflava n1165的反式阿魏酰辅酶a合成酶和烯酰辅酶a水合酶，构建了全细胞大肠杆菌生物催化剂，在高温下生产香兰素(ni et al.angewandte chemie-internationaledition 57(5),1214-1217)。然而，其宿主极端微生物生活环境十分恶劣，需要特定的营养需求或生长条件，在实验室中难以复制，因此发现和培养起来相对困难。相应地，随着自然环境的变化，在极端微生物
2、随着生物信息学、计算生物学等领域的发展，利用酶祖先序列重建方法，我们能够利用计算机算法从灭绝的生物体中推导出古老酶的氨基酸序列。先前的研究主要集中在复活进化树根部最古老的祖先形式。然而，在酶的进化过程中，从最古老的祖先到现存的形式，酶经历了无数种环境，包括极端条件。这些环境挑战可能施加了选择压力，可能会导致祖先酶适应和发展有利的特性，例如增强的热稳定性。因此，在这种进化景观中，我们很有可能找到极端嗜热的祖先酶，从而提出本专利技术。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了通过揭示进化景观的分子水平信息，设计了构建祖先酶序列-结构-动力学参数库的工作流程，即assmd策略，并利用该策略发现嗜热腈水解酶(ec 3.5.5.1)，该酶能催化腈化合物水解为羧酸，广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种目标祖先酶的挖掘方法，包括如下步骤：
3、s1、从数据库中收集待挖掘的酶的序列，进化树分析待挖掘的酶的进化景观，获取位于进化树分支点的多种祖先酶的氨基酸序列，构建一级结构文库；
4、s2、对s1获得的多种祖先酶进行三级结构预测，构建三级结构文库；
5、s3、对s2中的三级结构进行分子动力学模拟，获得均方根偏差，筛选出均方根偏差较低的祖先酶，得到目标祖先酶。
6、进一步地，在步骤s3中，所述获得均方根偏差的方法为：先对祖先酶进行30ns的分子动力学模拟，分子动力学模拟结束后，收集动力学模拟过程中的均方根偏差rmsd值(衡量腈水解酶碳原子在分子动力学模拟过程中的稳定性)。在本专利技术中，rmsd的收敛值为分子动力学模拟rmsd稳定后的平均值。
7、进一步地，所述待挖掘的酶包括腈水解酶。
8、本专利技术的第二个目的是提供一种祖先腈水解酶或其突变体，所述祖先腈水解酶的氨基酸序列为seq id no.1所示或与其同源性不低于80％的序列，优选地，同源性不低于90％。
9、进一步地，祖先腈水解酶突变体通过seq id no.1所示祖先腈水解酶突变得到，所述的突变包括：
10、将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸；
11、或将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸；
12、或将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸；
13、或将第155位的组氨酸突变为酪氨酸；
14、或将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸，并将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸；
15、或将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸，并将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸；
16、或将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸，并将第155位的组氨酸突变为酪氨酸；
17、或将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸，并将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸；
18、或将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸，并将第155位的组氨酸突变为酪氨酸；
19、或将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸，并将第155位的组氨酸突变为酪氨酸；
20、或将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸，并将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸；
21、或将将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸，并将第155位的组氨酸突变为酪氨酸；
22、或将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸，并将第155位的组氨酸突变为酪氨酸；
23、或将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸，将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸，并将第155位的组氨酸突变为酪氨酸；
24、或将第97位的丝氨酸突变为谷氨酸，将第101位的丝氨酸突变为丙氨酸，将第124位的天冬酰胺突变为组氨酸，并将第155位的组氨酸突变为酪氨酸。
25、本专利技术的第三个目的是提供编码所述祖先腈水解酶或其突变体的基因。
26、进一步地，编码所述祖先腈水解酶基因的序列如seq id no.3所示。
27、本专利技术的第四个目的是提供携带所述基因的重组表达载体。
28、本专利技术的第五个目的是提供含有所述基因的表达框。
29、进一步地，所述表达框包括表达所述基因必要的原件和/或辅助表达的原件，如启动子、终止子、信号肽、rbs等。
30、本专利技术的第六个目的是提供表达所述祖先腈水解酶或其突变体的重组细胞。
31、进一步地，所述重组细胞的宿主细胞包括微生物，如大肠杆菌。
32、本专利技术的第七个目的是提供一种生产祖先腈水解酶或其突变体的方法，包括采用所述重组细胞进行发酵生产的步骤。
33、本专利技术的第八个目的是提供所述祖先腈水解酶或其突变体、基因、重组表达载体、表达框或重组细胞在水解腈类化合物中的应用。
34、进一步地，所述应用包括，以所述祖先腈水解酶、突变体或重组细胞为催化剂，催化腈类化合物转化为羧酸和氨。
35、本专利技术的第九个目的是提供一种腈水解酶的特异性片段，所述特异性片段的氨基酸序列如seq id no.2所示。该特异性片段可被用于鉴定、机制研究等。
36、本专利技术的有益效果：
37、本专利技术基于assmd(祖先酶序列-结构-分子动力学参数文库)策略发现，腈水本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种目标祖先酶的挖掘方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.一种祖先腈水解酶或其突变体，其特征在于，所述祖先腈水解酶的氨基酸序列为SEQID NO.1所示或与其同源性不低于80％的序列。
3.根据权利要求2所述的祖先腈水解酶或其突变体，其特征在于，祖先腈水解酶突变体通过所述祖先腈水解酶突变得到，所述的突变包括：
4.编码权利要求2或3所述祖先腈水解酶或其突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组表达载体。
6.含有权利要求4所述基因的表达框。
7.表达权利要求2或3所述祖先腈水解酶或其突变体的重组细胞。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为腈水解酶的特异性片段，所述特异性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.权利要求2或3所述祖先腈水解酶或其突变体、权利要求4所述基因、权利要求所5述重组表达载体、权利要求6所述表达框或权利要求7所述重组细胞在水解腈类化合物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括，以所述祖先腈水解酶或
...【技术特征摘要】
1.一种目标祖先酶的挖掘方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.一种祖先腈水解酶或其突变体，其特征在于，所述祖先腈水解酶的氨基酸序列为seqid no.1所示或与其同源性不低于80％的序列。
3.根据权利要求2所述的祖先腈水解酶或其突变体，其特征在于，祖先腈水解酶突变体通过所述祖先腈水解酶突变得到，所述的突变包括：
4.编码权利要求2或3所述祖先腈水解酶或其突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组表达载体。
6.含有权利要求4所述基因的表达框。
【专利技术属性】
技术研发人员：龚劲松，汪子凯，史劲松，冯丹婷，陆震鸣，许正宏，苏畅，李恒，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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