【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学技术，更具体地，涉及靶向mettl3的sgrna以及定点敲低mettl3蛋白表达转基因小鼠的构建方法和应用。
技术介绍
1、基因工程小鼠是指通过转基因技术将外源基因整合到染色体，并能稳定遗传的小鼠模型。在当代生物学和医学研究领域中，模型生物的选用和创制已成为揭示基因功能与疾病机理的关键步骤。在众多模型生物中，基因敲除小鼠模型一直是遗传学家极为珍贵的工具。鉴于小鼠与人类大约共享99％的相同基因，小鼠成为模拟大多数人类生物过程的理想选择。此外，小鼠因其体积小、生命周期短且繁殖能力强，而被广泛用作实验动物。因此有目的地在小鼠中敲除一个基因成为确定遗传等位基因生物学作用的关键手段。
2、crispr/cas9技术作为一种革命性的基因编辑工具，因其独特的高效性、便捷性和广泛的适用范围，已经被广泛的应用于多个物种上的基因编辑。crispr/cas9系统，当grna、crrna与cas蛋白共同存在情况下，可对靶基因位点进行切割，切割后的位点可以通过非同源末端连接方式或同源末端连接的方式进行修复，最终对目标位点实现突变(随机插入/缺失)、外源片段的定点敲入等多种修饰。
3、人类雌性生殖系统的正常生理功能依赖于生殖内分泌系统的性腺轴，它调节排卵和月经周期。正常妊娠的维持依赖于子宫内膜的接受态、正常的胚胎发生以及母胎界面免疫微环境。多项研究表明，m6a修饰与女性生殖系统生理功能的调节有关。例如，通过控制pgr mrna的翻译，通过m6a修饰，mettl3对于胚胎发育过程中的p4信号转导至关重要。m6a
4、m6a的形成是一个动态且可逆的过程，具有甲基转移酶活性的m6a“写入者”由三个独立的蛋白组成：甲基转移酶样蛋白3(mettl3)、甲基转移酶样蛋白14(mettl14)、wilms瘤相关蛋白(wtap)、甲基转移酶相关蛋白(virma)。甲基转移酶复合物通过mettl3和mettl4以及调节亚基wtap催化m6a的修饰。首先，证明了mettl3是m6a甲基转移酶，其表达可以直接影响m6a的总甲基化水平，对mrna稳定性有显著影响，从而影响细胞功能。mettl14与mettl3能够形成稳定的复合物，这一复合物在底物识别过程中扮演着至关重要的角色。此外，mettl3为体外人子宫内膜基质细胞分化所必需。目前，利用crispr/cas9技术构建的体内定点敲除mettl3的小鼠尚未见报导。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供靶向mettl3的sgrna。
2、本专利技术的第二个目的是提供含有权利要求1所述靶向mettl3的sgrna的dna片段。
3、本专利技术的第三个目的是提供一种构建tgsgmettl3过表达转基因小鼠模型的方法。
4、本专利技术的第四个目的是提供一种定点敲低mettl3蛋白表达转基因小鼠的构建方法。
5、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
6、本专利技术首先提供靶向mettl3的sgrna，所述sgrna为sgrna1和sgrna2，分别如seqid no.1和seq id no.2所示。
7、本专利技术还提供含有所述靶向mettl3的sgrna的dna片段(seq id no.4)，所述dna片段的自5’端到3’端依次包括u6启动子、sgrna1、u6启动子、sgrna2、u6启动子、seq id no.3所示的sggfp编码基因、cag启动子编码基因、mcherry编码蛋白、sv40 poly(a)编码基因、mcherry编码蛋白、p2a肽编码基因、gfp编码基因、bgh poly(a)编码基因。
8、本专利技术还提供一种构建tgsgmettl3过表达转基因小鼠模型的方法，是利用piggybac转座酶系统将权利要求2中所述dna片段整合到小鼠基因组中，后通过基因型鉴定筛选获得。
9、优选地，是通过体外转录的方式，获得piggybac mrna；将piggybac mrna和所述dna片段的piggybac显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得转基因阳性首建鼠；将所述述基因阳性首建鼠与野生型小鼠杂交获得后代使用基因型鉴定筛选获得所述tgsgmettl3过表达转基因小鼠模型。
10、本专利技术还提供一种定点敲低mettl3蛋白表达转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：
11、(1)将ltfcre/+小鼠与rosa26lslcas9/+小鼠杂交获得后代，通过基因型鉴定筛选获得ltfcre/+rosa26lslcas9/+小鼠；
12、(2)将权利要求3得到的tgsgmettl3过表达转基因小鼠与ltfcre/+rosa26lslcas9/+小鼠杂交，获得小鼠后代，后通过基因型鉴定筛选获得定点敲低mettl3蛋白表达转基因小鼠。
13、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
14、本专利技术结合crispr/cas9技术构建获得的tgsgmettl3过表达转基因小鼠模型能够在全身表达mettl3的向导rna，配合设计好的定点表达cas9蛋白的小鼠就能实现定点敲低mettl3表达小鼠，为研究mettl3基因功能提供了新的工具和思路。
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1.靶向Mettl3的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2，分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.含有权利要求1所述靶向Mettl3的sgRNA的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的自5’端到3’端依次包括U6启动子、sgRNA1、U6启动子、sgRNA2、U6启动子、SEQ ID NO.3所示的sgGFP编码基因、CAG启动子编码基因、mcherry编码蛋白、SV40 poly(A)编码基因、mcherry编码蛋白、P2A肽编码基因、GFP编码基因、bGH poly(A)编码基因。
3.一种构建TGsgMettl3过表达转基因小鼠模型的方法，其特征在于，是利用PiggyBAC转座酶系统将权利要求2中所述DNA片段整合到小鼠基因组中，后通过基因型鉴定筛选获得。
4.一种定点敲低Mettl3蛋白表达转基因小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.靶向mettl3的sgrna，其特征在于，所述sgrna为sgrna1和sgrna2，分别如seq idno.1和seq id no.2所示。
2.含有权利要求1所述靶向mettl3的sgrna的dna片段，其特征在于，所述dna片段的自5’端到3’端依次包括u6启动子、sgrna1、u6启动子、sgrna2、u6启动子、seq id no.3所示的sggfp编码基因、cag启动子编码基因、mcherry...
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