【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，涉及了一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的制备方法及其在基因沉默方面的应用，尤其的，是涉及通过突变得到了一种具有更高切割活性、底物通用性和基因沉默能力的苏糖核酶，并将其应用于选择性沉默肺癌细胞中发生耐药突变的egfr。
技术介绍
1、非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，死亡率与发病率均居癌症榜首。表皮生长因子受体(egfr)是细胞膜上的一种受体激酶，其在非小细胞肺癌细胞表面过表达，进而驱动癌细胞增殖。肺癌靶向抗癌药物——egfr酪氨酸激酶抑制剂能结合egfr，抑制激酶活性，达到治疗效果。但多数非小细胞肺癌患者在使用靶向药后，会有耐药现象发生。耐药的主要原因是患者的egfr第20号外显子转录本发生了一个单位点的c→u突变，导致egfr蛋白第790号的苏氨酸(t)突变为了甲硫氨酸(m)。
2、rna是将遗传信息从dna传递到蛋白质的信使，还承担着基因表达调控等重要生理作用，对编码egfr的mrna进行切割，可以实现对egfr基因的沉默。核酶和脱氧核酶可以通过折叠形成有催化活性的空间结构，加速多种化学反应的进行，例如rna切割反应。因此，一部分(脱氧)核酶能催化靶基因mrna的断裂，从而实现基因沉默。相比于蛋白质，(脱氧)核酶易于大规模化学合成与修饰、设计简单、易于储存，是有潜力的基因沉默工具分子。但目前发现的一些骨架为dna或rna的天然(脱氧)核酶具有明显的不足，限制了其进一步应用。首先，天然核酶通常需要远高于生理浓度的金属离子来发挥作用；另外，天然核酶生物稳定性差，难以完成较长时间的持续作用；最
3、苏糖核酸(tna)是一种由四碳糖环构成的、能够与rna形成稳定配对的非天然核酸。由于tna能够抵抗核酸酶的降解，所以tna具有优越的生物稳定性。前期已经通过体外筛选获得了能够催化rna切割反应的tna酶(苏糖核酶)tz1，该酶可以特异性切割含有egfrt790m耐药突变的转录本，达到基因沉默的效果，而不切割野生型的转录本。然而，tz1在细胞内的基因沉默效果还有较大的优化空间，并且tz1作为工具分子的底物通用性也需要进一步优化。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术目的是针对原有的苏糖核酶的不足，通过优化得到一种催化活性、底物通用性都显著提高的苏糖核酶tz2，并将其应用于选择性沉默肺癌细胞中发生耐药突变的egfr。
2、本专利技术的技术方案是：本专利技术所述的一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的制备方法，其制备步骤如下：
3、步骤(1)：通过tna的引物延伸反应，制备将苏糖核酶tz1所在家族中的14个非保守位点逐个突变为其他三种碱基后的变体；
4、步骤(2)：测试上述单点突变的变体对rna底物的切割活性，筛选出活性高于野生型苏糖核酶tz1的变体；
5、步骤(3)：对筛选得到的有催化活性提升的突变位点进行组合多点突变；
6、步骤(4)：测试上述组合多点突变后的变体对rna底物的切割活性，筛选出活性最高的变体，即得到苏糖核酶tz2的序列，再进行大批量的tna的引物延伸反应，从而制备得到大量的苏糖核酶tz2。
7、进一步的，通过对原有苏糖核酶tz1进行a3c、t22a、g28c组合多点突变后得到的苏糖核酶tz2，其在20mm mg2+中的催化速率为苏糖核酶tz1的两倍。
8、进一步的，所述苏糖核酶tz2的长度为20-1000nt。
9、进一步的，所述苏糖核酶tz2为含有seq1的或与该seq1序列80％以上同源的序列：该同源的序列包括在seq1基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个或几个碱基后得到的序列：
10、seq1为agggcatgagaagtcttattggtggatgaagcgatgagttgc。
11、进一步的，所述苏糖核酶还包括seq1中下划线部分的序列替换为其他任意序列后的序列。
12、进一步的，制备的一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的应用。
13、进一步的，所述的应用，具体包括：
14、应用(1)：苏糖核酶tz2可切割4条不同的、具有生理意义的rna模型序列；
15、应用(2)：苏糖核酶tz2能对包括egfr的第20号外显子转录本和egfr部分开放阅读框在内的长片段rna底物进行切割；
16、应用(3)：苏糖核酶tz2可选择性地敲降发生耐药突变的细胞中的egfr，并造成细胞毒性和凋亡。
17、进一步的，应用(1)中的底物通用性测试，鉴定出将苏糖核酶tz2的两侧结合臂部分替换为其他任何序列后其活性基本保持不变；使用苏糖核酶tz2变体靶向nipbl、ywhaq、alk和pik3ca靶点对应的模式转录本，其都能特异性识别并切割底物。
18、进一步的，在应用(2)中，对于egfr的第20号外显子转录本和egfr部分开放阅读框长底物序列，苏糖核酶tz2即使在生理浓度的mg2+缓冲液中，也可高活性、特异性地切割突变型底物。
19、进一步的，在应用(3)中，苏糖核酶tz2可对含有耐药突变的肺癌细胞的egfr进行敲降；
20、苏糖核酶tz2可选择性地对含有耐药突变的肺癌细胞造成显著的细胞凋亡。
21、本专利技术的有益效果是：本专利技术所述的苏糖核酶与现有的脱氧核酶(如10-23)相比，具有优异的生物稳定性和较低的二价金属离子依赖性；所述的苏糖核酶与原有苏糖核酶tz1相比，其在20mm和2mm mg2+中的催化速率约为tz1的两倍，且保留了对突变底物的识别能力；通过底物通用性测试，鉴定出将所述的苏糖核酶的两侧结合臂部分替换为其他任何序列后，其活性基本保持不变；使用所述的苏糖核酶变体靶向4个不同的、具有生理意义的mrna模型，其都能特异性识别并切割底物；对于egfr第20号外显子(186nt)和部分egfr转录本(1000nt)长片段底物序列，所述的苏糖核酶即使在生理浓度的mg2+中，也可以高活性、特异性地切割突变型底物；所述苏糖核酶可以对含有耐药突变的肺癌细胞的egfr进行有效敲降，而对野生型肺癌细胞的egfr无影响或影响较小；所述苏糖核酶可以选择性地对含有耐药突变的肺癌细胞造成显著的细胞凋亡，而对野生型肺癌细胞造成的影响较弱；这一专利技术为生物医药
，尤其是基因沉默介导的肿瘤治疗提供了一个具有良好应用前景的分子工具。
【技术保护点】
1.一种具有RNA切割活性的苏糖核酶Tz2的制备方法，其特征在于，其制备步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种具有RNA切割活性的苏糖核酶Tz2的制备方法，其特征在于，通过对原有苏糖核酶Tz1进行A3C、T22A、G28C组合多点突变后得到的苏糖核酶Tz2，其在20mM Mg2+中的催化速率为苏糖核酶Tz1的两倍。
3.根据权利要求1所述的一种具有RNA切割活性的苏糖核酶Tz2的制备方法，其特征在于，所述苏糖核酶Tz2的长度为20-1000nt。
4.根据权利要求1所述的一种具有RNA切割活性的苏糖核酶Tz2的制备方法，其特征在于，所述苏糖核酶Tz2为含有seq1的或与该seq1序列80％以上同源的序列：该同源的序列包括在seq1基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个或几个碱基后得到的序列：
5.根据权利要求1所述的一种具有RNA切割活性的苏糖核酶Tz2的制备方法，其特征在于，所述苏糖核酶还包括seq1中下划线部分的序列替换为其他任意序列后的序列。
6.如权利要求1-5任意一项制备方法制备的一种具有RNA切割活性的
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体包括：
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：应用(1)中的底物通用性测试，鉴定出将苏糖核酶Tz2的两侧结合臂部分替换为其他任何序列后其活性基本保持不变；使用苏糖核酶Tz2变体靶向NIPBL、YWHAQ、ALK和PIK3CA靶点对应的模式转录本，其都能特异性识别并切割底物。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在应用(2)中，对于EGFR的第20号外显子转录本和EGFR部分开放阅读框长底物序列，苏糖核酶Tz2即使在生理浓度的Mg2+缓冲液中，也可高活性、特异性地切割突变型底物。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在应用(3)中，苏糖核酶Tz2可对含有耐药突变的肺癌细胞的EGFR进行敲降；
...【技术特征摘要】
1.一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的制备方法，其特征在于，其制备步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的制备方法，其特征在于，通过对原有苏糖核酶tz1进行a3c、t22a、g28c组合多点突变后得到的苏糖核酶tz2，其在20mm mg2+中的催化速率为苏糖核酶tz1的两倍。
3.根据权利要求1所述的一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的制备方法，其特征在于，所述苏糖核酶tz2的长度为20-1000nt。
4.根据权利要求1所述的一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的制备方法，其特征在于，所述苏糖核酶tz2为含有seq1的或与该seq1序列80％以上同源的序列：该同源的序列包括在seq1基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个或几个碱基后得到的序列：
5.根据权利要求1所述的一种具有rna切割活性的苏糖核酶tz2的制备方法，其特征在于，所述苏糖核酶还包括se...
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