【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及针对改善的亮氨酸和/或异亮氨酸的产生进行遗传修饰的微生物，并且涉及使用所述微生物改善亮氨酸和/或异亮氨酸产生的方法。
技术介绍
1、氨基酸用于许多工业领域，包括食品、动物饲料、化妆品、制药和化学工业，并且具有估计为5％至7％的全球市场年增长率(leuchtenberger等人,2005)。其中，亮氨酸和异亮氨酸对于人和许多家畜物种的营养特别重要，因为它们是哺乳动物无法合成的必需氨基酸。因此，它们通常用作食品添加剂以及用于膳食补充剂中，其中亮氨酸也用作增味剂。亮氨酸和异亮氨酸还尤其在抗生素(如聚酮化合物)的合成中起前体的作用。
2、亮氨酸和异亮氨酸可以经由化学合成、从蛋白质水解物中提取或微生物发酵来产生。在这些技术中，由于相关的经济和环境优势，发酵是当今最常用的。特别地，发酵提供了使用丰富的、可再生的和/或廉价的材料作为主要碳源的有用方式。此外，虽然当使用化学合成时，产生等摩尔量的d-对映异构体和l-对映异构体二者，因而需要l-对映异构体的另外的下游分离，但是发酵仅产生l-对映异构体。亮氨酸和异亮氨酸通过发酵进行的生物合成通常使用棒状杆菌属(corynebacterium)或埃希菌属(escherichia)的微生物，如谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(escherichia coli)进行。
3、最初，通过随机诱变分离产生亮氨酸和异亮氨酸的菌株。然而，最近，已经对微生物进行了合理的代谢工程化，其中改善氨基酸产生的策略主要集中在去除反馈抑制、改良
4、作为例子，对于异亮氨酸，可以通过掺入抗反馈的苏氨酸脱水酶和天冬氨酸激酶iii(在大肠杆菌中分别由ilva和lysc编码)改善氨基酸产生，而去除leua的反馈抑制可以改善亮氨酸产生。作为进一步的例子，可以通过在大肠杆菌过表达编码l-亮氨酸特异性输出蛋白的leue基因或缺失编码l-亮氨酸特异性转运蛋白的livk基因来改善产生(park等人,2010)。
5、鉴于工业应用中对亮氨酸和异亮氨酸的需求不断增长，仍然需要进一步改善这些氨基酸的产生。特别地，仍然需要改善的微生物，所述改善的微生物能够以高水平的生产率、滴度和产率产生亮氨酸或异亮氨酸，特别是从廉价和/或丰富的碳源(如葡萄糖)产生亮氨酸或异亮氨酸。还需要用于在工业规模上产生亮氨酸或异亮氨酸的改善的方法，理想地，其中亮氨酸或异亮氨酸的生产率、滴度和产率至少与用当前方法获得的相似。
技术实现思路
1、本专利技术解决了以上需求，提供了一种针对亮氨酸和/或异亮氨酸的产生进行遗传修饰的微生物以及一种使用所述微生物产生亮氨酸和/或异亮氨酸的方法。与未经修饰的微生物相比，针对亮氨酸和/或异亮氨酸的产生进行遗传修饰的微生物显著表达编码nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶的异源gapn基因，并且具有编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶a的gapa和编码柠檬酸合酶的glta的减弱的表达。事实上，诸位专利技术人已经发现，通过这样的微生物有利地示出改善的亮氨酸或异亮氨酸的产生，因为生产率、滴度和产率增加。
2、优选地，所述gapn基因编码的nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶与来自变形链球菌(streptococcus mutans)的gapn具有至少80％同一性。
3、优选地，所述gapa基因被缺失。
4、优选地，与未经修饰的微生物相比，所述微生物进一步包含gapb和/或gapc基因的表达的减弱，优选所述gapb和gapc基因的缺失。
5、优选地，与未经修饰的微生物相比，所述微生物进一步包含选自acka、pta和acs的至少一种基因的过表达。
6、优选地，所述微生物针对亮氨酸的产生进行遗传修饰，并且与未经修饰的微生物相比，包含以下基因的过表达：ilvbn、ilvc、ilvd、leua*、leub、leuc、leud和ilve。
7、优选地，所述微生物针对异亮氨酸的产生进行遗传修饰，并且包含：
8、a)异源cima*基因的表达，
9、b)与未经修饰的微生物相比，以下基因的过表达：ilvih*、ilvc、ilvd、leub、leuc、leud和ilve，以及
10、c)leua基因的减弱。
11、优选地，与未经修饰的微生物相比，所述微生物进一步包含：
12、a)选自以下的至少一种基因的表达的减弱：udha、aceef、sucab、poxb、brnq、livkhmgf、adhe、ldha、frdabcd、mgsa、pflab、zwf、edd、eda和gnd，和/或
13、b)选自pntab、gdha、leue和ygazh的至少一种基因的过表达。
14、优选地，在所述微生物中，选自以下的至少一种基因被缺失：udha、aceef、sucab、poxb、brnq、livkhmgf、adhe、ldha、frdabcd、mgsa、pflab、zwf、edd、eda和gnd。
15、优选地，所述微生物属于埃希菌属，更优选地其中所述微生物是大肠杆菌(e.coli)；棒状杆菌属，更优选地其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌(c.glutamicum)；或链球菌属(streptococcus)，更优选地其中所述微生物选自嗜热链球菌(s.thermophilus)和唾液链球菌(s.salivarius)；最优选地其中所述微生物是大肠杆菌。
16、本专利技术进一步涉及一种用于产生亮氨酸和/或异亮氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
17、a)在包含碳源的适当的培养基中培养如本文所提供的针对亮氨酸和/或异亮氨酸的产生进行遗传修饰的微生物，以及
18、b)从所述培养基中回收亮氨酸和/或异亮氨酸。
19、优选地，所述培养基进一步包含乙酸盐。
20、优选地，所述碳源是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和/或蔗糖。
21、优选地，所述方法的步骤b)包括结晶步骤。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种针对亮氨酸和/或异亮氨酸的产生进行遗传修饰的微生物，其中所述微生物包含以下修饰：
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述gapN基因编码的NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶与来自变形链球菌(Streptococcus mutans)的GapN具有至少80％同一性。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述gapA基因被缺失。
4.根据权利要求3所述的微生物，所述微生物进一步包含与未经修饰的微生物相比，gapB和/或gapC基因的表达的减弱，优选所述gapB和gapC基因的缺失。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微生物，所述微生物进一步包含与未经修饰的微生物相比，选自ackA、pta和acs的至少一种基因的过表达。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物，其中所述微生物针对亮氨酸的产生进行遗传修饰，并且与未经修饰的微生物相比，包含以下基因的过表达：ilvBN、ilvC、ilvD、leuA*、leuB、leuC、leuD和ilvE。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物，其中所述微生
8.根据权利要求1至7中任一项所述的微生物，与未经修饰的微生物相比，所述微生物进一步包含：
9.根据权利要求8所述的微生物，其中选自以下的至少一种基因被缺失：udhA、aceEF、sucAB、poxB、brnQ、livKHMGF、adhE、ldhA、frdABCD、mgsA、pflAB、zwf、edd、eda和gnd。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于埃希菌属(Escherichia)，优选地其中所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)；棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选地其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；或链球菌属(Streptococcus)，优选地其中所述微生物选自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和唾液链球菌(Streptococcus salivarius)；更优选地其中所述微生物是大肠杆菌。
11.一种用于产生亮氨酸和/或异亮氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述培养基进一步包含乙酸盐。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和/或蔗糖。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中步骤b)包括结晶步骤。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种针对亮氨酸和/或异亮氨酸的产生进行遗传修饰的微生物，其中所述微生物包含以下修饰：
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述gapn基因编码的nadp依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶与来自变形链球菌(streptococcus mutans)的gapn具有至少80％同一性。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述gapa基因被缺失。
4.根据权利要求3所述的微生物，所述微生物进一步包含与未经修饰的微生物相比，gapb和/或gapc基因的表达的减弱，优选所述gapb和gapc基因的缺失。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微生物，所述微生物进一步包含与未经修饰的微生物相比，选自acka、pta和acs的至少一种基因的过表达。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物，其中所述微生物针对亮氨酸的产生进行遗传修饰，并且与未经修饰的微生物相比，包含以下基因的过表达：ilvbn、ilvc、ilvd、leua*、leub、leuc、leud和ilve。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物，其中所述微生物针对异亮氨酸的产生进行遗传修饰，并且包含：
8.根据权利要求1至7中任一项所述的微生物，与未经修饰的微生物相比，所述微生物进一步包含：
...【专利技术属性】
技术研发人员：T·德福杰斯，C·雷诺，P·索凯尔，P·瓦瑟，
申请(专利权)人：代谢探索者公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。