【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学领域，具体涉及一种耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法。
技术介绍
1、小细胞外囊泡(small extracellular vesicle,sev)是由各种细胞分泌的直径在30-200nm。在小的细胞外囊泡中包含很多的蛋白质、核酸和脂质等多种生物活性物质，并且其存在磷脂双分子层的结构可以保护内含物不被体内的蛋白酶降解。sev的内含物可以从供体细胞传递到受体细胞参与细胞间的信号交流，作为一种细胞内的介质它可以参与细胞增殖，免疫调节，组织修复等多种生理和病理过程。
2、起初对于sev的研究主要聚焦在体外培养体系中的研究，随着对于sev的更加深入的研究发现，体外体系中的sev的功能无法替代体内的真实环境中sev所表现出来的功能。因为体外的环境单一是一种理想化的情况，而体内存在多种细胞是一个复杂的多元化交流的环境。因此，对于组织sev的研究可以更好的反应真实环境中sev发挥的生物学功能。目前，对于组织sev的研究主要是在较大的组织中，如大脑、脂肪组织、癌变组织。用于组织分离sev的方法主要是采用酶消化组织后再使用超速离心、尺寸排阻和密度梯度的方式进行sev的分离。但是对于不同的组织采用的酶的种类以及分离方法都不尽相同。内耳作为一种生物器官其大小相对于其他的组织器官很小，因此在获得sev的过程中就会面临样本收集困难的问题，所以得到一种高效的提取内耳组织sev的分离纯化方法至关重要。也正是因为内耳组织很小，无论在体外培养体系还是体内体系获取sev都很不易。
3、专利技术人在前期研究中发现，耳蜗组织se
4、因此，本专利技术提出一种高效提取内耳组织外泌体的方式可以填补在内耳组织sev提取中的空白，进一步推进sev在听觉领域的研究。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提出了一种耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法。
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
3、本专利技术的第一方面，涉及一种耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，包括以下步骤：
4、将所述耳蜗组织的基底膜、螺旋韧带与蜗轴放入培养皿中培养，并切块；
5、加入酶进行消化处理；
6、消化后的耳蜗通过超速离心法、蔗糖密度梯度法或者尺寸排阻法处理，分离获得耳蜗组织小细胞外囊泡。
7、可选地，所述超速离心法包括以下步骤：进行300g，10min离心去除大的碎片，取上清后进行2000g，20min离心去除大的细胞碎片；取上清用0.22μm过滤；收集滤液后进行16500g，离心20min去除大囊泡；取上清后进行110000g，2h的超速离心；去除上清，用dpbs重悬sevs。
8、可选地，所述蔗糖密度梯度法包括以下步骤：
9、对耳蜗组织进行差速离心法分离处理；
10、依次加入浓度由低至高的蔗糖溶液，配置蔗糖密度梯度溶液；
11、再将耳蜗组织加入蔗糖密度梯度溶液中，再进行离心处理；
12、取上清以及重悬后获得所述耳蜗组织小细胞外囊泡。
13、可选地，所述尺寸排阻法包括以下步骤：
14、对耳蜗组织进行差速离心法分离处理；
15、分离后的溶液进行浓缩处理，再加入sec-qev柱子中；
16、再加入pbs溶液，分组收集sec-qev柱子下端流出的液体，获得所述耳蜗组织小细胞外囊泡。
17、可选地，所述浓度由低至高的蔗糖溶液分别为0.6mol/l、1.3mol/l、2.5mol/l的蔗糖溶液。
18、可选地，所述消化采用的酶为3型胶原酶、木瓜蛋白酶，或d型胶原酶联合d nase1。
19、可选地，所述消化处理包括以下步骤：在耳蜗组织中加入3型胶原酶进行消化，再将耳蜗组织放置冰上，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂终止消化。
20、可选地，所述消化处理包括以下步骤：向耳蜗组织中加入d型胶原酶和dnase1进行消化，再将耳蜗组织放置冰上终止消化。
21、可选地，所述消化处理包括以下步骤：向耳蜗组织中加入木瓜蛋白酶进行消化，再将耳蜗组织放置冰上，加入蛋白酶抑制剂终止消化。
22、本专利技术的第二方面，涉及上述耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法在听觉研究中的应用。
23、本专利技术的有益效果：
24、本专利技术通过结合与改进现有的sev提取技术，获得了最优适用于内耳组织sevs的提取方式。本专利技术将在一定程度上促进听觉领域中sevs的研究。
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1.一种耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述超速离心法包括以下步骤：进行300g，10min离心去除大的碎片，取上清后进行2000g，20min离心去除大的细胞碎片；取上清用0.22μm过滤；收集滤液后进行16500g，离心20min去除大囊泡；取上清后进行110000g，2h的超速离心；去除上清，用DPBS重悬sEVs。
3.根据权利要求1所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述蔗糖密度梯度法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述尺寸排阻法包括以下步骤：
5.根据权利要求3所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述浓度由低至高的蔗糖溶液分别为0.6Mol/L、1.3Mol/L、2.5Mol/L的蔗糖溶液。
6.根据权利要求1所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述消化采用的酶为3型胶原酶、木瓜蛋白酶，或者D型胶原酶联合DNase 1。<...
【技术特征摘要】
1.一种耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述超速离心法包括以下步骤：进行300g，10min离心去除大的碎片，取上清后进行2000g，20min离心去除大的细胞碎片；取上清用0.22μm过滤；收集滤液后进行16500g，离心20min去除大囊泡；取上清后进行110000g，2h的超速离心；去除上清，用dpbs重悬sevs。
3.根据权利要求1所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述蔗糖密度梯度法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述尺寸排阻法包括以下步骤：
5.根据权利要求3所述的耳蜗组织小细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述浓度由低至高的蔗糖溶液分别为0.6mol/l、1.3mol/l、2.5mol/l的蔗糖溶液。<...
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