本发明专利技术公开了一种用于快速检测虾肝肠胞虫的MB‑qPCR检测试剂盒及检测方法，属于农业和水产生物检测技术领域。所述试剂盒包括Tris‑HCl、含U的dNTP、KCl、MgCl<subgt;2</subgt;、Tween‑20、四氢噻吩1‑氧化物、四甲基氯化铵、甜菜碱、DMSO、Triton X‑100，以及序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物和如SEQ ID NO.3所示的MB荧光探针。本发明专利技术还提供了使用该试剂盒检测虾肝肠胞虫的方法，不仅能快速检测虾肝肠胞虫，该试剂盒还具有敏感性高、特异性强、检测范围广的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农业和水产生物检测，具体涉及一种用于快速检测虾肝肠胞虫的mb-qpcr检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、虾肝肠胞虫(enterocytozoon hepatopenaei,ehp)，是近年在虾养殖行业发现的一种专门性细胞内寄生病原体，容易感染凡纳滨对虾、脊尾白虾和斑节对虾等主要经济养殖虾类，是影响全球虾类养殖生产的重要病原之一。感染虾肝肠胞虫的个体前期无明显的症状，中期行动迟缓且伏底、嗜睡、食欲下降、应激能力下降、甲壳松弛等；感染2-3个月时，病虾生长速度减缓甚至停止生长，其体型仅为健康虾的一半大小，个别病虾出现排白便症状。虽然感染虾肝肠胞虫的对虾不会发生急性死亡，但造成的对虾滞长，且症状随着感染时间的增加而加重, 可能引起对虾的慢性死亡，严重影响了对虾养殖业和食品安全，从而导致较大的经济损失。
2、目前，虾肝肠胞虫的检测技术取得了较大的进展，建立了虾肝肠胞虫的组织学检测技术、分子生物学检测技术等，比如在中国专利技术专利201710917654.4中通过恒温扩增方法提供了一种检测虾肝肠孢虫的荧光试剂盒，虽然无精密实验仪器设备需求，但其特异性较低，容易出现假阳性等问题；在中国专利技术专利201811501504.6中基于虾肝肠胞虫的swp1基因保守区域设计了一组引物，但pcr扩增后需要进行琼脂糖凝胶电泳，在开盖过程中易造成气溶胶污染，且该方法检测限高，易出现假阴性，耗时耗力。因此，设计高效实用的虾肝肠胞虫的检测试剂盒具有重要意义和应用价值。
技术实现思路
>1、针对现有技术的缺陷，本专利技术设计了一种用于快速检测虾肝肠胞虫的mb-qpcr检测试剂盒以及使用该试剂盒的检测方法，具有操作简便、高特异性、高灵敏度以及无气溶胶污染的特点。2、为了实现上述目的，本专利技术解决技术问题采用如下技术方案：
3、一方面，本专利技术基于mb-qpcr技术设计了一种用于快速检测虾肝肠胞虫的mb-qpcr检测试剂盒，mb-qpcr 具有操作简单、敏感、并能对样品进行实时扩增检测，且其与普通的线性寡核苷酸探针相比，茎环型结构的分子信标对靶序列中单个碱基的错配、缺失或插入突变均能检测出来。
4、所述试剂盒包括mb-qpcr mix、enzyme mix、阴性质控品、阳性质控品；其中所述mb-qpcr mix包括20mm~80m且ph为7.5~8.9的tris-hcl、10mm~50mm 含u的dntp、100mm~4mkcl、1mm~50mm mgcl2、0.01%~0.3%（v/v）tween-20、0.01%~0.1%（v/v）四氢噻吩1-氧化物、10mm~5m 四甲基氯化铵、10mm~100mm甜菜碱、0.01%~0.1%（v/v） dmso、0.01%~0.3%（v/v）triton x-100、50mm~500mm上游引物、50mm~500mm下游引物、25mm~250mm mb荧光探针。
5、优选地，所述上游引物是如seq id no.1所示的序列，所述下游引物是如seq idno.2所示的序列，所述mb荧光探针是如seq id no.3所示的序列。
6、优选地，所述mb荧光探针的5’端连接有荧光发光基团，且3’端连接有荧光猝灭基团。所述荧光发光基团包括fam、vic、hex、joe、rox、texas-red、cy5的一种；所述荧光猝灭基团包括dabcyl、dabsyl、tamra、bhq-1、bhq-2、bhq-3的一种。
7、优选地，所述enzyme mix包括热启动taq酶0.5u~2u、udg酶0.1u~10u、rnaseinhibiter 1u~10u、1%~50%（v/v）甘油、10mm~200mm的钾离子与0.01mm~1mm的edta。
8、优选地，所述阳性质控品包括利用如seq id no.4所示的虾肝肠胞虫靶基因序列合成的质粒溶液。
9、另一方面，本专利技术还提供了一种非诊断目的检测虾肝肠胞虫的方法，采用所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的mb-qpcr检测试剂盒。
10、优选地，所述方法包括以下步骤：
11、s1:提取样本核酸；
12、s2:将步骤s1提取的核酸作为模板，进行pcr扩增反应，反应结束后对检测结果进行判定。
13、优选地，所述步骤s2中采用25μl的pcr扩增体系，包括19μl mb-qpcr mix、1μl酶混合液、5μl模板。
14、优选地，所述pcr扩增反应条件为：95℃ 3min；95℃ 10s，58℃ 30s，40个循环。
15、优选地，所述结果判定为：当ct值＜35且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性；当35≤ct＜37扩增曲线呈s型，可疑样本需复检；复检结果一致则判断为虾肝肠胞虫阳性，否则为虾肝肠胞虫阴性；当ct值≥37或无扩增曲线，结果为阴性。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
17、本专利技术通过mb-qpcr技术提供了一种检测虾肝肠胞虫的试剂盒，为检测虾肝肠胞虫
提供了新思路，所述试剂盒具有操作简便、高特异性、高灵敏度的特点。
18、相比现有的普通pcr技术，本专利技术的试剂盒以及检测方法操作简单，并且pcr结束后可直接进行结果判读，整个检测在30min内即可检验出结果，减少了人力物力及时间成本，可以对虾肝肠胞虫实现实时监控，有利于及时发现和响应病毒爆发，以及评估虾健康养殖的风险，为指导对虾科学养殖提供了理论依据。
19、并且，本专利技术无需开盖等后续实验处理与分析，避免了不同扩增产物间的交叉污染，同时也减少假阳性的发生，测试结果准确可靠。
20、此外，所述试剂盒可于室温下存放一周，4℃放置半年，-20℃存放2年，反复冻融10次以上对其性能不造成任何影响。
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【技术保护点】
1.一种用于快速检测虾肝肠胞虫的MB-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括MB-qPCR Mix、Enzyme Mix、阴性质控品、阳性质控品；其中所述MB-qPCR Mix包括20mM~80M且PH为7.5~8.9的Tris-HCl、10mM~50mM含U的dNTP、100mM~4M KCl、1mM~50mM MgCl2、0.01%~0.3%（V/V）Tween-20、0.01%~0.1%（V/V）四氢噻吩1-氧化物、10mM~5M 四甲基氯化铵、10mM~100mM甜菜碱、0.01%~0.1%（V/V）DMSO、0.01%~0.3%（V/V）Triton X-100、50mM~500mM上游引物、50mM~500mM下游引物、25mM~250mM MB荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的MB-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物是如SEQ ID NO.1所示的序列，所述下游引物是如SEQ ID NO.2所示的序列，所述MB荧光探针是如SEQ ID NO.3所示的序列。
3.根据权利要求2所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的MB-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述MB荧光探针的5’端连接有荧光发光基团，且3’端连接有荧光猝灭基团；所述荧光发光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Texas-Red、Cy5的一种；所述荧光猝灭基团包括DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3的一种。
4.根据权利要求1所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的MB-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述Enzyme Mix包括热启动Taq酶0.5U~2U、UDG酶0.1U~10U、Rnase inhibiter 1U~10U、1%~50%（V/V）甘油、10mM~200mM的钾离子与0.01mM~1mM的EDTA。
5.根据权利要求1所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的MB-qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括利用如SEQ ID NO.4所示的虾肝肠胞虫靶基因序列合成的质粒溶液。
6.一种非诊断目的检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的MB-qPCR检测试剂盒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中采用25μL的PCR扩增体系，包括19μL MB-qPCR Mix、1μL酶混合液、5μL模板。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：95℃ 3min；95℃10s，58℃ 30s，40个循环。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述结果判定为：当Ct值＜35且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性；当35≤Ct＜37扩增曲线呈S型，可疑样本需复检；复检结果一致则判断为虾肝肠胞虫阳性，否则为虾肝肠胞虫阴性；当Ct值≥37或无扩增曲线，结果为阴性。
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【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测虾肝肠胞虫的mb-qpcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括mb-qpcr mix、enzyme mix、阴性质控品、阳性质控品；其中所述mb-qpcr mix包括20mm~80m且ph为7.5~8.9的tris-hcl、10mm~50mm含u的dntp、100mm~4m kcl、1mm~50mm mgcl2、0.01%~0.3%（v/v）tween-20、0.01%~0.1%（v/v）四氢噻吩1-氧化物、10mm~5m 四甲基氯化铵、10mm~100mm甜菜碱、0.01%~0.1%（v/v）dmso、0.01%~0.3%（v/v）triton x-100、50mm~500mm上游引物、50mm~500mm下游引物、25mm~250mm mb荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的mb-qpcr检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物是如seq id no.1所示的序列，所述下游引物是如seq id no.2所示的序列，所述mb荧光探针是如seq id no.3所示的序列。
3.根据权利要求2所述的用于快速检测虾肝肠胞虫的mb-qpcr检测试剂盒，其特征在于，所述mb荧光探针的5’端连接有荧光发光基团，且3’端连接有荧光猝灭基团；所述荧光发光基团包括fam、vic、hex、joe、rox、texas-red、cy5的一种；所述荧光猝灭基团包括dabcyl、dabsyl、tamra、bhq-1、bhq-2、bhq-3的一种。
【专利技术属性】
技术研发人员：马铃铃，谭杰峰，徐艳琼，凌嘉慧，付英豪，
申请(专利权)人：广州奕昕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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